一种高表达miR-146a-5p的外泌体抑制THP-1分化的方法技术

本发明专利技术涉及生物信息技术领域，具体涉及一种高表达miR

【技术实现步骤摘要】
一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化的方法


[0001]本专利技术涉及生物信息
，具体为一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪性肝病（Non
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alcoholic fatty liver disease, NAFLD）已成为全球流行率最高的慢性肝脏疾病，研究显示27%的NAFL患者会进展成NASH阶段，一旦进展至NASH，则需要进行药物治疗干预，但目前尚无特异性治疗的有效药物。
[0003]研究表明，巨噬细胞M1极化可以加重NASH的进展，外泌体具有高度生物兼容性、逃逸溶酶体介导的降解和可进行人工修饰等特点，因此，我们可以把外泌体作为miRNAs的运输载体将目的miRNAs靶向运载至特定组织发挥调节作用，前期研究已证明miR
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146a
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5p是 LPS诱导的固有免疫和炎症反应的负调控因子，且miR
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146a
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5p可以抑制LPS处理后THP
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1细胞中炎症因子IL
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1β、IL
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6和TNF
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α的释放，因此本专利技术提出一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法。

技术实现思路

[0004]针对相关技术中的问题，本专利技术提出的一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法，包括以下步骤：S1、高表达miR
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146a
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5p外泌体的制备；S2、外泌体的鉴定；S3、细胞的培养；S4、外泌体miR
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146a
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5p与THP
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1或巨噬细胞共孵育；S5、实验结果的分析。
[0006]进一步的，所述步骤S1具体为：（1）分别将50 nmol/L miR
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146a
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5p mimic或阴性对照转染至HepG2细胞中，转染48 h后收集细胞培养基上清；（2）通过超速离心的方法得到高表达miR
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146a
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5p的外泌体和对照组外泌体。
[0007]进一步的，所述步骤S2具体为：（1）取20μl提取完成的外泌体溶液，通过透射电子显微镜镜下观察并拍照记录外泌体的形态；（2）取20μl提取完成的外泌体悬液至新的1.5ml的EP管，加入20μlRIPA（注意加入cocktail,50:1）,裂解充分后，按4:1（外泌体悬液：SDS）的比例加入5
×
SDS（含β－巯基乙醇）溶液，置于100
°
C水浴中煮沸5min，收取蛋白样品进行电泳，检测外泌体标记蛋白CD63的
表达情况；（3）从外泌体中分离总RNA,将miRNA逆转录为cDNA，以U6为内参，定量miR
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146a
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5p的表达。
[0008]进一步的，所述步骤S3具体为：（1）HepG2在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，THP
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1在含10%胎牛血清的RPMI
‑
1640培养基中培养，两种细胞均在37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养；（2）向悬浮培养的THP
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1细胞中加入PMA至终浓度为100ng/ml以诱导THP
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1分化为巨噬细胞。
[0009]进一步的，所述步骤S4具体为：（1）将高表达miR
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146a
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5p的外泌体或对照组外泌体加入至THP
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1或THP
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1分化的巨噬细胞中（外泌体终浓度为50μg/ml）共孵育48h；（2）以U6为内参，定量THP
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1和巨噬细胞内miR
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146a
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5p的表达；以18S为内参,定量巨噬细胞内 MCP
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1、TNF
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a、IL
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6的表达；（3）收集细胞样品于1.5mLEP管中， RIPA裂解充分后，以4:1加入5
✖
SDS（含β－巯基乙醇），获取蛋白样品,电泳完后，检测THP
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1细胞内CD68和巨噬细胞内CD86的表达情况。
[0010]进一步的，所述步骤S5具体为：（1）与对照组相比，Mimic
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146a
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5p组HepG2细胞内和细胞培养上清的外泌体中miR
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5p的表达均明显升高；（2）高表达miR
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146a
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5p的外泌体与THP
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1或巨噬细胞共孵育48h后，THP
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1或巨噬细胞内miR
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5p的表达明显升高；（3）高表达miR
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146a
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5p的外泌体可以减少巨噬细胞促炎因子MCP
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1、TNF
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a、IL
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6的释放;（4）高表达miR
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5p的外泌体可以降低THP
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1细胞内巨噬细胞标志物CD68的表达；（5）高表达miR
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5p的外泌体可以降低M1型巨噬细胞标志物CD86的表达。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术为一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法，本专利技术中通过化学转染的方法制备了肝细胞来源的高表达miR
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146a
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5p的外泌体证明其抑制抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的作用；（2）本专利技术为一种高表达miR
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5p的外泌体抑制THP
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1分化和巨噬细胞M1极化的方法，本专利技术通过先转染后超速离心的方法获得的外泌体完整性好，纯度高；（3）本专利技术为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、高表达miR
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146a
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5p外泌体的制备；S2、外泌体的鉴定；S3、细胞的培养；S4、外泌体miR
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146a
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5p与THP
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1或巨噬细胞共孵育；S5、实验结果的分析。2.根据权利要求1所述的一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化的方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：（1）分别将50 nmol/L miR
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146a
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5p mimic或阴性对照转染至HepG2细胞中，转染48 h后收集细胞培养基上清；（2）通过超速离心的方法得到高表达miR
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146a
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5p的外泌体和对照组外泌体。3.根据权利要求1所述的一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：（1）取20μl提取完成的外泌体溶液，通过透射电子显微镜镜下观察并拍照记录外泌体的形态；（2）取20μl提取完成的外泌体悬液至新的1.5ml的EP管，加入20μlRIPA,裂解充分后，按4:1的比例加入5
×
SDS溶液，置于100
°
C水浴中煮沸5min，收取蛋白样品进行电泳，检测外泌体标记蛋白CD63的表达情况；（3）从外泌体中分离总RNA,将miRNA逆转录为cDNA，以U6为内参，定量miR
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146a
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5p的表达。4.根据权利要求1所述的一种高表达miR
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146a
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5p的外泌体抑制THP
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1分化的方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：（1）HepG2在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，THP
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1在含10%胎牛血清的RPMI
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1640培养基中培养，两种细胞均在37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养；（2）向悬浮培养的THP
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1细胞中加入PMA至终浓度为100ng/ml以诱导THP
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1分...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘守胜，耿宁，王艺奋，辛永宁，
申请(专利权)人：青岛市市立医院，
类型：发明
国别省市：