葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法，重组葡萄糖氧化酶的制备方法包括如下步骤：A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化；B）、金属络合物与黑磷纳米片和葡萄糖氧化酶的辅基偶联；C）、葡萄糖氧化酶的重组。本发明专利技术将葡萄糖氧化酶重组到含有电子传递接力点的黑磷纳米片上，成功地研制出了具有极低氧化还原电位的葡萄糖生物传感膜；由该葡萄糖生物传感膜制备的葡萄糖生物传感器，不仅保持了对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位（

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法。

技术介绍

[0002]近几年迅速发展起来的持续葡萄糖监测系统以其使用方便和实时监测等特点，受到越来越多的糖尿病患者的青睐。作为持续葡萄糖监测系统的核心部件，葡萄糖生物传感器的性能直接决定了持续葡萄糖监测系统的性能和使用寿命。现有的持续葡萄糖监测系统所使用的葡萄糖生物传感器可以分为两类。一类是通过电化学方法检测葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化过程中生成的过氧化氢来对葡萄糖进行间接监测，例如德康的Dexcom G5和G6和美敦力的Guardian和iPro 2。它们依赖组织液中的氧气来实现对葡萄糖的监测，而组织液中的氧气含量远远低于葡萄糖的含量，因此，组织液中氧气的含量就成了制约这类持续葡萄糖监测系统的性能的主要因素，也就是所谓的“氧匮乏”现象。更为重要的是，过氧化氢的电化学检测要求较高的检测电位，因而大大地降低了持续葡萄糖监测系统的抗干扰能力，特别是对常用药物如乙酰氨基酚的抗干扰能力。另外，过氧化氢对葡萄糖氧化酶具有很强的破坏作用，从而严重地影响传感器的稳定性和使用寿命。虽然经过40多年不懈的研究和探索，其性能还远远不能满足葡萄糖持续监测的需要。例如，美敦力的Guardian和iPro 2每天还需要进行两次校正，它们的使用寿命也只有一个星期。
[0003]为了克服以上问题，Dr. Heller等人引入了氧化还原高分子，开发出了可以用于生物传感器的“酶线技术”。基于此原理发展起来了另一类生物传感技术，即第二代生物传感技术。第二代生物传感技术目前已被广泛应用于生物传感器,特别是葡萄糖生物传感器，包括各种一次性血糖检测试纸条和持续葡萄糖监测系统，例如雅培糖尿病护理的FreeStyle Libre和FreeStyle Libre 2。通过对氧化还原高分子的分子设计和优化，葡萄糖的检测可以在50~100毫伏下进行。虽然持续葡萄糖监测系统的抗干扰能力得到了改善，但由于氧化还原高分子对抗坏血酸的电化学催化氧化作用，在此电位下，抗坏血酸的干扰非常严重。另外，由于氧化还原高分子为高分子材料，制备难于得到精确的控制，给动态血糖仪的性能带来不确定性。更重要的是这些氧化还原高分子必须与葡萄糖氧化酶进行相当程度的化学交联以后，才能够形成葡萄糖氧化酶所需的酶线。这一方面大大缩短了葡萄糖氧化酶溶液的使用寿命，无形中增加了动态血糖仪的生产成本。更为严重的是，随着使用时间的增加，化学交联反应越来越多，葡萄糖氧化酶溶液的粘度也越来越大，从而严重地影响到产品的一致性。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术在于提供葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法，该方法将葡萄糖氧化酶重组到带有电子传递接力点的黑磷纳米片上，成功地研制出了极低氧化还原电位的葡萄糖氧化酶的直接电化学。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：葡萄糖氧化酶的制备方法，包括如
下步骤：A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：A1）、将葡萄糖氧化酶溶于3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离；A2）、弃上层离心液，沉淀溶于0.1~2mol/L的醋酸钠溶液中，并将醋酸钠溶液加入至3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离，重复该步骤多次；A3）、弃上层离心液，用12~36mmol/L的第一磷酸缓冲溶液清洗沉淀物，然后将沉淀物在0.01~0.1mol/L的第二磷酸缓冲溶液中进行透析，最后进行干燥，得到脱辅基化的葡萄糖氧化酶；B）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：B1）、将黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸加入至N，N
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二甲基甲酰胺中进行混合，通氩气除氧，在剧烈搅拌下，室温反应1~5小时后，将温度升高至120~150℃，继续反应36~72小时；其中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.1~1）：（0.5~5）；B2）、将步骤B1）得到的反应液进行离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复多次进行提纯；B3）、在黑磷纳米片上接入电子传递接力点：将提纯后的羧基化的黑磷纳米片、带有游离氨基和羧基的金属络合物、碳化二亚胺以及N
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羟基琥珀酰亚胺进行混合反应；其中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.1~2）：（0.01~0.5）：（0.05~0.3）：（0.001~0.1）；B4）、反应结束后，再次离心分离，弃上层离心液，并清洗沉淀物，得到偶联后的黑磷纳米片；C）、葡萄糖氧化酶的重组：C1）、将偶联后的黑磷纳米片、N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，碳化二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺加入至磷酸缓冲溶液中进行反应；其中，所述N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺和所述N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（10~200）：（20~120）：（5~20）；C2）、反应结束后，进行离心分离和清洗纯化，得到带有N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；C3）、将脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片加入至HEPES缓冲溶液中进行培养；C4）、培养结束后，加入硼氢化钠，继续进行反应；所述脱辅基化的葡萄糖氧化酶、所述带有N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和所述硼氢化钠的重量比为（0.1~2）：（0.5~5）：（0.1~3）；C5）、反应结束后，进行离心分离，并对沉淀物进行清洗和离心分离。
[0006]作为优选，在步骤A1）和步骤A2）中，所述硫酸铵的浓度均为4.5~6mol/L。
[0007]作为优选，在步骤A3）中，第一磷酸缓冲溶液的浓度为18~27mmol/L，第二磷酸缓冲溶液的浓度为0.03~0.08mol/L。
[0008]作为优选，在步骤B1）中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.3~0.6）：（2.6~3.5）。
[0009]作为优选，在步骤B3）中，所述金属络合物中的金属包括铜、铁、镍、钌、或锇。
[0010]作为优选，在步骤B3）中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.5~1.2）：（0.15~0.3）：（0.1~0.22）：（0.015~0.05）。
[0011]作为优选，在步骤C1）中，所述N6
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（6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和所述碳化二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（80~150）：（30~60）：（8~15）。
[0012]作为优选，在步骤C4）中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：A1）、将葡萄糖氧化酶溶于3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离；A2）、弃上层离心液，沉淀溶于0.1~2mol/L的醋酸钠溶液中，并将醋酸钠溶液加入至3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离，重复该步骤多次；A3）、弃上层离心液，用12~36mmol/L的第一磷酸缓冲溶液清洗沉淀物，然后将沉淀物在0.01~0.1mol/L的第二磷酸缓冲溶液中进行透析，最后进行干燥，得到脱辅基化的葡萄糖氧化酶；B）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：B1）、将黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸加入至N，N
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二甲基甲酰胺中进行混合，通氩气除氧，在剧烈搅拌下，室温反应1~5小时后，将温度升高至120~150℃，继续反应36~72小时；其中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.1~1）：（0.5~5）；B2）、将步骤B1）得到的反应液进行离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复多次进行提纯；B3）、在黑磷纳米片上接入电子传递接力点：将提纯后的羧基化的黑磷纳米片、带有游离氨基和羧基的金属络合物、碳化二亚胺以及N
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羟基琥珀酰亚胺进行混合反应；其中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.1~2）：（0.01~0.5）：（0.05~0.3）：（0.001~0.1）；B4）、反应结束后，再次离心分离，弃上层离心液，并清洗沉淀物，得到偶联后的黑磷纳米片；C）、葡萄糖氧化酶的重组：C1）、将偶联后的黑磷纳米片、N6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，碳化二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺加入至磷酸缓冲溶液中进行反应；其中，所述N6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺和所述N
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羟基琥珀酰亚胺的重量比为（10~200）：（20~120）：（5~20）；C2）、反应结束后，进行离心分离和清洗纯化，得到带有N6
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氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；C3）、将脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6
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氨基己基）黄素腺嘌呤...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈薇，
申请(专利权)人：苏州中星医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：