一株聚羟基丁酸高产菌株的筛选及鉴定方法技术

本发明专利技术提供一株聚羟基丁酸高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：制作培养基；利用培养基对聚羟基丁酸菌株进行分离；将获得的聚羟基丁酸菌株提取和纯化,本发明专利技术还提供一株聚羟基丁酸高产菌株的鉴定方法，与现有技术相比，本发明专利技术具有如下的有益效果：克服化学合成法高成本的不足，从环境中筛选出一株高产PHB的微生物菌株，经16sRNA序列测序鉴定和生理生化鉴定菌株为铜绿假单胞菌，为Aeruginosa属，Pseudomonas种。并通过微生物发酵工艺，获得高产量、高纯度的PHB。高纯度的PHB。高纯度的PHB。

【技术实现步骤摘要】
0.6g/L，柠檬酸2g/L，pH 7.0；
[0015]上述培养基均在121℃条件下灭菌20min。
[0016]作为一优选的实施方式，利用培养基对聚羟基丁酸菌株进行分离包括：在活性污泥中获取样本，取3mL水样加入30mL富集培养基里(30℃，200r/min)好氧培养24h，采用稀释平板涂布的方法，利用筛选培养基，尼罗蓝平板筛选(30℃)，培养48h，将平板放在荧光透射仪下照射挑取荧光较强且菌落较大的菌落，并苏丹黑B染色镜检观察PHB的黑色颗粒，获得的高产PHB菌株的单菌落接种到发酵培养基中，30℃，200rpm发酵培养72h后，离心获取沉淀检测PHB的含量及菌体干重，利用斜面保藏培养基斜面保藏PHB产量最高的菌株，进行下一步试验。
[0017]作为一优选的实施方式，将获得的聚羟基丁酸菌株提取和纯化包括，获得的产PHB菌株的单菌落接种到发酵培养基中，30℃，200rpm发酵培养72h后，离心获取菌体沉淀。
[0018]一株聚羟基丁酸高产菌株的鉴定方法，经16sRNA序列测序鉴定和生理生化鉴定菌株，该菌株16S rRNA序列为：
[0019][0020][0021]采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：克服化学合成法高成本的不足，从环境中筛选出一株高产PHB的微生物菌株，经16sRNA序列测序鉴定和生理生化鉴定菌株为铜绿假单胞菌，为Aeruginosa属，Pseudomonas种。并通过微生物发酵工艺，获得高产量、高纯度的PHB。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为PHB
‑
4菌落形态图和革兰氏染色以及苏丹黑染色形态特征图。
[0024]图2为产PHB菌株PHB
‑
4菌株16s rRNA序列进化树。
[0025]图3为PHB样品的扫描电镜形态特征图。
[0026]图4为PHB样品的傅里叶红外衍射(FTIR)分析图谱。
具体实施方式
[0027]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]本专利技术提供一种技术方案：一株聚羟基丁酸高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：
[0029]制作培养基；
[0030]利用培养基对聚羟基丁酸菌株进行分离；
[0031]将获得的聚羟基丁酸菌株提取和纯化。
[0032]作为一优选的实施方式，培养基的具体培养基配方和培养条件包括：
[0033]富集培养基(g/L)：甘油10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，KH2PO4 10.0g/L，无需额外调节pH；
[0034]筛选培养基(g/L):甘油20.0g/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，琼脂20g/L，尼罗兰0.03g/L，pH 7.0；
[0035]斜面保藏培养基(g/L):甘油5.0g/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，pH 6.5；
[0036]发酵培养基(g/L):甘油20g/L，(NH4)2SO4 10.0g/L，KH2PO4 10.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，pH 7.0；
[0037]上述培养基均在121℃条件下灭菌20min。
[0038]利用培养基对聚羟基丁酸菌株进行分离包括：在活性污泥中获取样本，取3mL水样加入30mL富集培养基里(30℃，200r/min)好氧培养24h，采用稀释平板涂布的方法，利用筛选培养基，尼罗蓝平板筛选(30℃)，培养48h，将平板放在荧光透射仪下照射挑取荧光较强且菌落较大的菌落，并苏丹黑B染色镜检观察PHB的黑色颗粒，获得的高产PHB菌株的单菌落接种到发酵培养基中，30℃，200rpm发酵培养72h后，离心获取沉淀检测PHB的含量及菌体干重，利用斜面保藏培养基斜面保藏PHB产量最高的菌株，进行下一步试验。
[0039]从废水水样中直接分离得到一株具有高产PHB性状的细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Aeruginosa属，Pseudomonas种，命名为PHB
‑
4。
[0040]将获得的聚羟基丁酸菌株提取和纯化包括，获得的产PHB菌株的单菌落接种到发
次固定涂片，加入苏丹黑染色10min，水洗，加入二甲苯，完全脱色后，水洗去除残留的二甲苯，吸干水分；加上番红后，染色2min，水洗；吸干水分后，油镜镜检。在100倍油镜下观察菌体的形态。图1E是菌株PHB
‑
4培养至72h的革兰氏染色显微镜图片，图中显示该菌株为格兰氏阴性细菌。图1F是PHB
‑
4的苏丹黑染色显微镜图片。
[0053]最终结果如表1。
[0054]表1产PHB菌株PHB
‑
4的生理生化鉴定表
[0055][0056][0057]其中，抗生素敏感性中，++表示强作用，+表示弱作用，
‑
表示无作用。
[0058](四)产PHB菌株PHB
‑
4的16s rRNA基因同源序列分析：
[0059]具体实施过程：斜面保藏培养基上挑取单菌落，转接到斜面保藏液体培养基中，30℃，200rpm，振荡培养72h后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按操作步骤进行全基因组提取。根据细菌16S rRNA基因序列设计通用引物(Bf
‑
F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；Bf
‑
R，ACGGCTACCTTGTTACGACTT)并由生工(上海)生物技术有限公司合成。
[0060]按以下反应体系和反应条件进行16S rRNA基因扩增：
[0061]反应体系(20μL)：无菌双蒸水，12μL；5
×
Buffer，4μL；dNTP，1.6μL；Bf
‑
R(10μM)，0.6μL；Bf
‑
F(10μM)，0.6μL；基因组模板，1μL；Primer STAR DNA Polymerase(Takara)，0.2μL；
[0062]反应程序：预变性94℃4min，变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃90s，30次循环，延伸72℃10min。
[0063]PCR产物经多功能DNA纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株聚羟基丁酸高产菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：制作培养基；利用培养基对聚羟基丁酸菌株进行分离；将获得的聚羟基丁酸菌株提取和纯化。2.如权利要求1所述的一株聚羟基丁酸高产菌株的筛选方法，其特征在于：培养基的具体培养基配方和培养条件包括：富集培养基(g/L)：甘油10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，KH2PO4 10.0g/L，无需额外调节pH；筛选培养基(g/L):甘油20.0g/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，琼脂20g/L，尼罗兰0.03g/L，pH 7.0；斜面保藏培养基(g/L):甘油5.0g/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，pH 6.5；发酵培养基(g/L):甘油20g/L，(NH4)2SO4 10.0g/L，KH2PO4 10.0g/L，无水MgSO4 0.6g/L，柠檬酸2g/L，pH 7.0；上述培养基均在121℃条件下灭菌20min。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：彭智辉，郭涛，王泽峰，许涛，
申请(专利权)人：郭涛，
类型：发明
国别省市：