一种高特异性的细胞分泌蛋白富集方法技术

分泌蛋白组学的研究在疾病的早期诊断，以及疾病的治疗方面都有着广泛的应用。传统分泌蛋白富集方法多采用无血清培养，但这一培养方式存在种种弊端。本发明专利技术提供了一种二步法肽段层面富集的蛋白富集流程，极大的提高了该方法的特异性。同时，本发明专利技术引入了一种可以替代甲硫氨酸的非自然氨基酸——叠氮基代丙氨酸(Azidohomoalanine，AHA)来对细胞自身合成的蛋白进行标记。再结合近年来广泛应用的点击化学反应，可以高效地将修饰了炔基的生物素(biotin)加到AHA的插入位点。借助生物素这一标记，便能够实现对含血清的培养基中分泌蛋白的分离纯化及鉴定。的分离纯化及鉴定。

【技术实现步骤摘要】
P，其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段；和
[0017](VI)第二富集步骤，包括步骤：
[0018](VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育，从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P；
[0019](Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段；和
[0020](Vc)洗脱目标肽段，从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。
[0021]在另一优选例中，使用所述方法富集获得的细胞分泌蛋白样品中，分泌蛋白占总蛋白的85％以上(以重量分数计)。
[0022]在另一优选例中，所述细胞是原代培养细胞。
[0023]在另一优选例中，所述细胞可以来源于肿瘤细胞系。
[0024]在另一优选例中，所述细胞可以来源于小鼠、大鼠、非人灵长类或人。
[0025]在另一优选例中，所述细胞可以来源于下组的原代培养细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞。
[0026]在另一优选例中，所述细胞是原代星形胶质细胞或成纤维细胞，优选地为原代星形胶质细胞。
[0027]在另一优选例中，所述细胞可以来源于胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)诱导分化得到的星形胶质细胞、小胶质细胞。
[0028]在另一优选例中，所述第一标签T1是AHA，所述第二标签T2是生物素，并且所述第三标签T3是链霉亲和素。
[0029]在另一优选例中，所述步骤(I)包括以下的的子步骤：
[0030](Ia)提供一细胞培养体系，所述细胞培养体系中的细胞的汇合率为70-95％(较佳地为80-92％，更佳地为80-90％)，并且其中所用培养基是第一培养基；
[0031](Ib)将步骤(I)中的细胞培养体系中的第一培养基更换为第二培养基，并进行培养，所述第二培养基中，不含有Met并且含有AHA(azidohomoalanine，叠氮基代丙氨酸)。
[0032]在另一优选例中，所述步骤(II)还包括以下的子步骤：
[0033](IIa)任选地对步骤(Ib)的培养所得培养液进行浓缩；
[0034](IIb)对步骤(Ib)的培养所得培养物或步骤(IIa)的浓缩所得的培养液进行化学点击(click)反应，其中从而获得被第二标签T2特异性地标记的细胞分泌蛋白S，即复合物T2-T1-S。
[0035]在另一优选例中，所述第一培养基中含有：DMEM 1.0、青/链霉素(Pen/Strep)、FBS血清，或其组合。
[0036]在另一优选例中，所述每500ml第一培养基由以下成分组成：450ml的DMEM1.0、5ml的Pen/Strep(100
×
)，和50ml的FBS。
[0037]在另一优选例中，所述第二培养基中含有AHA、FBS、Met去除培养基(depletion培养基)，其中FBS的浓度范围为0.3-2v/v％，较佳地为0.4-1.5v/v％，更佳地为0.5-1v/v％。
[0038]在另一优选例中，所述Met去除培养基中含有：DMEM 2.0、P/S、GlutaMax、丙酮酸钠、胱氨酸，或其组合。
[0039]在另一优选例中，并且所述Met去除培养基中的DMEM 2.0中不含有谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酰。
[0040]在另一优选例中，所述每500ml Met去除培养基由以下成分组成：484.5ml的DMEM2.0、5ml的Pen/Strep(100
×
)、5ml的GlutaMax(100
×
)、5ml的丙酮酸钠(100
×
)，和500μl的胱氨酸(1000
×
)。
[0041]在另一优选例中，所述第二培养基中各组成成分的体积比为：Met去除培养基：AHA(100mM)：FBS＝10ml：5μl：50μl。
[0042]在另一优选例中，在步骤(IIa)中，所述的浓缩包括将体积浓缩至1/25，较佳地1/40，更佳地1/50。
[0043]在另一优选例中，所述化学点击(click)反应的反应体系包括：三唑配体(Triazole ligand)、生物素-四聚乙二醇-炔烃(Biotin-PEG4-Alkyne)、溴化亚铜(CuBr)。
[0044]在另一优选例中，所述化学点击(click)反应的反应体系中，各组分的比例为：浓缩培养基：三唑配体(200mM)：生物素-四聚乙二醇-炔烃(25mM)：溴化亚铜(10mg/mL)＝1ml：2μl：4μl:20μl。
[0045]在另一优选例中，在步骤(III)中，所述固相载体Z0的材质选自下组：金属、玻璃、胶体、塑料，或其组合。
[0046]在另一优选例中，在步骤(III)中，所述的固相载体材质Z0包括：均聚物、共聚物，或其组合。
[0047]在另一优选例中，在步骤(III)中，所述的固相载体Z0的材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯，或其组合。
[0048]在另一优选例中，在步骤(III)中，所述的固相载体Z0是琼脂糖树脂。
[0049]在另一优选例中，在步骤(IV)中，所述未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的蛋白为培养基中的非特异性蛋白，如血清蛋白。
[0050]在另一优选例中，在步骤(IV)中，所需时间为12-24小时，较佳地为16-20小时，更佳地为18小时。
[0051]在另一优选例中，在步骤(IVa)中，所述的孵育时间为10-20小时，较佳地为14-16小时，更佳地为12小时。
[0052]在另一优选例中，在步骤(IVb)中，所述的洗涤包括两步洗涤，并且所述洗涤缓冲液包括用于第一步洗涤的第一洗涤缓冲液和用于第二步洗涤的第二洗涤缓冲液；其中，所述第一洗涤缓冲液为PBSN(PBS和1％NP-40)；所述第二洗涤缓冲液为20％已腈。
[0053]在另一优选例中，所述酸性洗脱所用的酸性洗脱液中含有：1-5％的三氟乙酸(TFA)、50％已腈。
[0054]在另一优选例中，所述酸性洗脱的洗脱条件为25-55℃，800-1200rpm震荡。
[0055]在另一优选例中，所述酸性洗脱的时间为5-20分钟，较佳地8-15分钟，最佳地10分钟。
[0056]在另一优选例中，所述消化反应的反应体系中包括：CaCl2、胰酶。
[0057]在另一优选例中，所述消化反应的反应体系中，CaCl2的浓度为0.5-2mM(较佳地0.8-1.5mM，更佳地1mM)，并且胰酶的浓度为1ug胰酶/100ug蛋白。
[0058]在另一优选例中，所述消化反应的反应温度为37℃。
[0059]在另一优选例中，所述消化反应的反应时间为12-20h，较佳地为14-18h，更佳地为16h。
[0060]在另一优选例中，在步骤(VI)中的反应在填料柱中进行，优选地，所述填料柱是C8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性地富集细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(I)提供一细胞培养体系，其中培养体系中的分泌蛋白S被第一标签T1特异性地标记，即所述细胞培养体系中含有复合物T1-S；(II)提供一可通过点击化学反应与第一标签特异性连接的第二标签T2，并使其与复合物T1-S发生点击化学反应，从而形成T2-T1-S复合物；(III)提供一结合于固相载体Z0的第三标签T3，所述第三标签T3能够与第二标签T2特异性地结合；(IV)第一富集步骤，包括子步骤：(IVa)使步骤(III)中的结合于固相载体的第三标签与步骤(II)中的T2-T1-S复合物共孵育，从而使标记有第一标签的分泌蛋白间接结合到固相载体上，从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-S；和(IVb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的非特异性蛋白；(V)洗脱和消化步骤，包括子步骤：(Va)将间接结合到固相载体上的分泌蛋白进行酸性洗脱，得到复合物T2-T1-S
’
；和(Vb)用胰酶对含有复合物T2-T1-S
’
的溶液进行消化反应，从而获得复合物T2-T1-P，其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段；和(VI)第二富集步骤，包括步骤：(VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育，从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P；(Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段；和(Vc)洗脱目标肽段，从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞可以来源于肿瘤细胞系。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用所述方法富集获得的细胞分泌蛋白样品中，分泌蛋白占总蛋白的85％以上(以重量分数计)。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞可以来源于胚胎干细胞(ESC)和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文元，刘洁，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：