一种天然胶原的N端精准接枝改性方法技术

本发明专利技术属于生物材料技术领域，具体涉及一种天然胶原的N端精准接枝改性方法。本发明专利技术采用“全氨基保护

【技术实现步骤摘要】
一种天然胶原的N端精准接枝改性方法


[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种天然胶原的N端精准接枝改性方法。

技术介绍

[0002]胶原，一种广泛存在于脊椎动物体内的结构性蛋白质，其典型结构特征为由3条肽链相互缠绕形成的三螺旋结构，直径约1.5nm，长度约300nm。胶原因具有良好的生物相容性、可生物降解性、优异的机械性能等优势而被广泛的应用于生物医学和组织工程材料领域。随着组织工程、临床医学、医学美容等领域对胶原基材料的性能指标和功能多样化的要求越来越高，胶原固有的物性、成胶性能以及生物稳定性等已不能完全满足实践应用需求。因此，通过对胶原固有结构和性能进行改性成为胶原基材料领域发展的必由之路。
[0003]目前，胶原改性领域的研究主要分为以下几个方面：（1）通过化学交联剂进行交联改性，利用简单的化学反应，如酰胺化、醛类交联等实现胶原表面官能团之间的共价键结合，可以有效的提高胶原基材料的热稳定性、耐酶降解性和机械性能，但是无法赋予其多样化的功能；（2）采用小分子化合物或聚合物对胶原侧链官能团进行接枝改性，通过共价键将多样化的分子接枝到胶原侧链活性基团（氨基、羧基等）上，可以赋予胶原基材料额外的性能，有利于实现胶原基材料功能的多样化。此外，牢固稳定的共价键连接方式有效避免了相分离问题，因此，该方法在胶原材料领域备受关注。
[0004]但是，常规的胶原接枝改性策略仍存在接枝位点和接枝密度无法精准控制、改性胶原产物分子结构不均一等问题。胶原的侧链官能团与其固有自组装性能和细胞调控性能息息相关，无法控制接枝位点的常规接枝改性策略无疑会对胶原的固有性能带来极大的负面影响。已有研究表明，胶原肽链两端的官能团（N端的氨基和C端的羧基）不会对其自组装行为和细胞调控性能等产生明显影响。因此，实现对胶原分子末端官能团的精准改造对于新颖的改性胶原基材料开发无疑具有重要的科学价值和实践意义。目前，胶原接枝改性领域最常用的官能团为氨基，主要包含N端α
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氨基和侧链赖氨酸的ε
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氨基，虽然二者的pKa值不同，但因实际反应活性相差甚微而难以实现N端氨基的选择性接枝。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种温和、简便、有效的天然胶原N端精准接枝改性方法，这种方法采用“全氨基保护
→
酶切端肽
→
N端精准接枝
→
脱保护”的策略，采用具端肽结构的天然胶原为原料，首先以氨基保护试剂保护胶原表面所有的活性氨基，进而采用酶水解法去除胶原的端肽结构，在胶原N端重新形成活性α
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氨基，通过酰胺化反应可以实现胶原N端氨基的精准接枝改性（侧链氨基已经被保护基保护），最后脱除胶原侧链氨基的保护基即可获得N端精准接枝改性胶原。该方法获得的改性胶原不仅能够具有接枝分子的性能，而且因侧链官能团未受影响而不会影响胶原固有性能。
[0006]本专利技术采用如下的技术方案：一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，包括如下步骤：
1）在低温条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原，得到胶原浓度为1～10mg/mL的胶原溶液；2）将步骤1所得胶原溶液用pH为8.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液（即PBS）中透析12～48h，除去醋酸分子；3）将氨基保护试剂滴加到步骤2所得溶液中，摇匀后，低温反应12～48h；4）将步骤3所得溶液透析除去未反应的氨基保护试剂，得到侧链保护的改性胶原；5）在步骤4所得侧链保护改性胶原溶液中，加入蛋白酶，在低温条件下水解除去胶原端肽结构，形成具有末端氨基/侧链保护的改性胶原；6）将步骤5所得溶液透析纯化，得到具有末端氨基/侧链保护的改性胶原；7）通过酰胺化反应，将接枝改性试剂加入步骤6所得溶液中，摇匀后，低温反应12～48h；8）对将步骤7所得溶液依次采用酸性溶液和纯水透析、冻干后，待用。
[0007]进一步地，所述步骤1）中，所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构和端肽结构的天然Ⅰ型胶原。低温条件为溶解温度小于20℃（温度过高会导致胶原蛋白变性）。
[0008]进一步地，所述步骤2）中，将步骤1所得胶原溶液置于截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，以pH为8.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液为透析液，在低于20℃下透析12～48h，直至透析液pH不再降低为止，每隔3～4h更换一次透析液；进一步地，所述步骤3）中，氨基保护试剂为能与氨基进行反应的常用保护试剂，包括但不限于：2,3
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二甲基马来酸酐、丁二酸酐、叔丁氧羰基（Boc）。（若试剂水溶性不够，可适量添加有机溶剂，如乙醇、丙酮、二甲亚砜、1,4
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二氧六环、N,N
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二甲基甲酰胺等作为助溶剂），氨基保护试剂与胶原的质量比为（0.5～2）:1，低温条件为溶解温度小于20℃。
[0009]进一步地，所述步骤4）中，所述透析操作采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，以pH为7.0～10.0的PBS为透析液，在低于20℃下透析12～48 h，每隔3～4 h更换一次透析液。
[0010]进一步地，所述步骤5）中，所述蛋白酶为可用于胶原端肽去除但不影响胶原三螺旋结构的酶，包括但不限于：胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及复合酶，酶的浓度为10～50 Unit/g，低温条件为温度小于20℃，根据所使用的酶，选择合适的pH条件；进一步地，所述步骤6）中，所述透析操作采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，以pH为7.0～10.0的PBS为透析液，在低于20℃下透析12～48 h，每隔3～4 h更换一次透析液。
[0011]进一步地，所述步骤7）中，接枝改性试剂为可与氨基进行酰胺化反应的化学试剂，包括但不限于：末端为羧基或者活化状态羧基的化合物（脂肪酸、N
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羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯）；进一步地，所述步骤8）中，所述透析操作采用截留分子量为12000～15000道尔顿的透析袋，在低于20℃下使用0.5mol/L的醋酸溶液透析12～48h，每隔3～4h更换一次透析液，再以纯水为透析液，透析12～48h，每隔3～4h更换一次透析液。
[0012]本专利技术的有益效果在于：
本专利技术采用“全氨基保护
→
酶切端肽
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N端精准接枝
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脱保护”的新型策略，以具端肽结构的天然胶原为原料，首先采用保护基团保护胶原表面所有的活性氨基，进而采用酶水解法去除胶原的端肽结构，在胶原N端重新获得活性α
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氨基，通过酰胺化反应可以实现胶原N端氨基的精准接枝改性（侧链氨基已经被保护基保护），最后脱除胶原侧链氨基的保护基即可获得N端精准接枝改性胶原。该方法实现了对天然胶原N端氨基的精准接枝改性，为胶原的进一步功能化提供了技术支持，拓展了改性胶原的应用领域。
[0013]本专利技术方法获得的改性胶原不仅具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，包括如下步骤：以醋酸水溶液溶解天然胶原，得到胶原溶液；胶原溶液透析，除去醋酸分子，得溶液A；滴加氨基保护试剂至溶液A，反应12～48h，得溶液B；溶液B透析，除去未反应的氨基保护试剂，得到侧链保护的改性胶原；向侧链保护改性胶原溶液中加入蛋白酶，以酶水解法除去胶原端肽结构，得到具有末端氨基/侧链保护的改性胶原溶液；具有末端氨基/侧链保护的改性胶原溶液透析纯化，得到溶液C；将接枝改性试剂加入溶液C中，摇匀，反应12～48h，得到溶液D；溶液D透析、冻干，得到N端精准接枝改性的天然胶原。2.如权利要求1所述的一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，其特征在于，（1）中，醋酸水溶液在低于20℃的条件下溶解天然胶原；其中，天然胶原是从脊椎动物的皮肤或跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构和端肽结构的天然Ⅰ型胶原；胶原溶液浓度为1～10mg/mL。3.如权利要求1所述的一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，其特征在于，（2）中，胶原溶液用pH为8.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液透析12～48h，除去醋酸分子。4.如权利要求1所述的一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，其特征在于，（3）中，氨基保护试剂为任选的，能与氨基进行反应的常用保护试剂，包括2,3
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二甲基马来酸酐、丁二酸酐、叔丁氧羰基类化合物、氯甲酸苄酯类化合物中的一种；氨基保护试剂与胶原的质量比为（0.5～2）:1。5.如权利要求1所述的一种天然胶原的N端精准接枝改性方法，其特征在于，（3）中，滴加氨基保护试剂至溶液A，添加助溶剂促进氨基保护试剂的溶解；其中助溶剂为任选...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军涛，汪海波，未本美，许承志，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：