miR-150及负载miR-150模拟物的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用制造技术

本发明专利技术涉及外泌体相关技术领域，尤其是涉及微小核糖核酸miR

【技术实现步骤摘要】
miR
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150及负载miR
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150模拟物的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用


[0001]本专利技术涉及外泌体筛选及转导
，尤其是涉及miR
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150及负载miR
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150 mimic的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球发病率位居第二、死亡率位居第三 的恶性肿瘤；约50％的CRC患者在病程中将出现结直肠癌肝转移(colorectal livermetastases，CRLM)，是导致患者死亡的主要原因，结直肠癌肝转移的治疗方式主 要有手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等相关综合治疗。对于那些无法手术的多发 性肝转移患者而言，内科综合治疗的转化率并不高。目前基因治疗肿瘤相关进展缓 慢，诸如腺病毒携带相关抗肿瘤基因用于癌症的治疗面临着相关安全性问题，而这 一问题目前仍没有很好的解决。人工合成的相关基因片段的直接输注又面临着外周 血核酸酶的降解问题。因而，结直肠癌肝转移的相关基因治疗进展举步维艰。
[0003]近年来，RNA干扰(RNA interfering，RNAi)技术作为新的基因治疗手段在 抗肿瘤、抗病毒等相关领域应用前景广阔，得到了迅速发展。自2016年美国FDA 批准首个用于治疗脊髓性肌萎缩的RNA药物Spinraza(Nusinersen)以来，多种 RNA药物已进入临床试验阶段，为遗传性疾病、肿瘤、感染等多个领域开创了新 的治疗方式。RNAi药物已被证实在多种病毒感染和肿瘤的中具有极大的潜力。
[0004]RNA类药物直接注射肿瘤组织或通过静脉注射方式给药会被组织中或血浆中 的核酸酶降解掉而无法达到治疗作用。因此，miRNA必须通过具有保护作用的运 输载体给药，才能保证miRNA的稳定性。有研究尝试采用腺相关病毒8(AAV8) 转导的方法增加体内特定miRNA的表达，显著抑制动物模型中肿瘤的进展。但腺 相关病毒或慢病毒作为miRNA的载体在治疗的探索中发现诸多问题：首先，这种 病毒进入人体后与非靶目标的细胞结合，改变相关细胞的基因稳定性，可能导致治 疗以外的副作用。其次，病毒进入宿主可以引发宿主免疫系统的识别，导致一系列 炎性介质的释放，导致体内免疫失衡和机体微环境紊乱。
[0005]结直肠癌肝转移治疗是临床工作中的难点，且发生转移的结直肠癌患者预后 较差，尤其是无法手术治疗的多发性肝转移患者整体预后更是不佳；而常规的化疗、 靶向治疗、免疫治疗等常常导致耐药给临床治疗带来极大困难。基因治疗采用腺病 毒载体存在一定的安全隐患，而将携带抗肿瘤基因的腺病毒直接输注的疗效亦缺乏 足够的临床证据；游离的基因直接行静脉注射亦有诸多问题，一则疗效不够确切， 二则外周血存在大量的核酸酶能够直接降解核酸；此外，这种直接输注无法准确把 握输注基因的产生效应的稳定浓度及剂量。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供微小核糖核酸miR
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150及负载 miR
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150mimic的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用。本专利技术采用外泌体荷 载抗癌微小核糖核酸miR
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150mimic对结直肠癌肝转移进行治疗。首先，本专利技术选 择正常肠上皮细胞来源的外泌体，对肿瘤及正常个体的生物学活性影响较小。本发 明中选择的miR
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150为前期筛选潜在具有抑制肿瘤的基因。其次，外泌体对其内 包含的miRNA具很强的保护作用，能够保护其内的RNA免于RNA酶的降解。最 后，人工合成的miR
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150mimic(miR
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150mimic为人工合成的miR
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150模拟物) 转导入外泌体并能够有效进入细胞内发挥生物学活性，在疗效上不论是体内实验还 是体外实验都体现出Exo
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miR
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150的抗肿瘤效应。
[0007]外泌体(exosomes)是由活细胞分泌的直径40
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120nm左右的细胞外囊泡，具 有脂质双层结构，其内容物包括各种活性物质，如miRNA、mRNA、DNA及蛋白 质等。由于有这种脂质膜结构，使得外泌体能够保护其内活性物质免于降解。同时， 其通过膜表面相应的配体或受体与相应的细胞结合、直接融合或被受体细胞吞噬， 释放内容物从而完成细胞间的信息交换。与人工的腺相关病毒或慢病毒载体相比， 外泌体在体内具有低免疫原性、低毒性、无诱导突变等特性，可作为miRNA体内 靶向运送的天然载体。有报道显示肿瘤细胞来源的外泌体对肿瘤具有一定的促进作 用，且与肿瘤细胞有一定的亲和性。本专利技术通过前期研究发现，正常肠上皮细胞来 源的外泌体对肠癌细胞的生长干预较小，且同样能够携带miRNA进入肿瘤细胞内。
[0008]本专利技术通过对正常人、结直肠癌无转移及结直肠癌肝转移患者外周血外泌体 miRNA进行芯片筛查发现，外泌体miR
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150在正常人、肠癌、肠癌肝转移患者外 周血外泌体中的表达逐渐降低。扩大样本研究发现，结直肠癌患者外周血外泌体 miR
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150的低表达与患者较差的预后密切相关，提高肿瘤细胞内miR
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150的表达能 够抑制肿瘤细胞的生长。这提示外泌体miR
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150不仅仅能够作为结直肠癌肝转移 的相关肿瘤标记物，亦可作为肿瘤个体化治疗的干预靶点。
[0009]本专利技术为外泌体负载抗癌微小核糖核酸miR
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150对结直肠癌肝转移进行治疗， 为结直肠癌肝转移的治疗提供新的方案及尝试。
[0010]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0011]本专利技术的第一个目的是提供miR
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150在制备治疗结直肠癌药物上的应用，所 述miR
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150序列为：3
’‑
GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU
‑5’
。
[0012]在本专利技术的一个实施方式中，miR
‑
150作为结直肠癌肝转移的相关肿瘤标记 物；
[0013]miR
‑
150还作为结直肠癌治疗的干预靶点。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用，所述外 泌体来自于正常肠上皮细胞。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，所述外泌体还适用于携载在发挥治疗作用之前容 易被人体组织或细胞代谢降解掉的药物，包括但不限于用于基因疗法的药物及分 子。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供负载有miR
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150mimic的外泌体在制备治疗结直 肠癌药物上的应用。负载有miR
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150mimic的外泌体是来自于正常肠上皮细胞的外 泌体。其中，所述miR
‑
150mimic为人工合成的miR...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.miR
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150在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，所述miR
‑
150序列为：3
’‑
GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU
‑5’
。2.根据权利要求1所述的miR
‑
150在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，miR
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150作为结直肠癌肝转移的相关肿瘤标记物；miR
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150还作为结直肠癌治疗的干预靶点。3.外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，所述外泌体来自于正常肠上皮细胞。4.根据权利要求3所述的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，所述外泌体还携载在发挥治疗作用之前容易被人体组织或细胞代谢降解掉的药物，包括但不限于用于基因疗法的药物及分子。5.负载有miR
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150mimic的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，负载有miR
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150mimic的外泌体为来自于正常肠上皮细胞的外泌体；所述miR
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150mimic为人工合成的miR
‑
150模拟物，所述miR
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150mimic有效工作序列为3
’‑
GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU
‑5’
，其茎环序列为：CUCCCCAUGGCCCUGUCUCCCAACCCUUGUACCAGUGCUGGGCUCAGACCCUGGUACAGGCCUGGGGGACAGGGACCUGGGGAC。6.根据权利要求5所述负载有miR
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150mimic的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用，其特征在于，负载有miR
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150mimic的外泌体的制备方法包括以下步骤：(1)载体外泌体的提取：利用ExoQuickTG外泌体提取试剂盒提取细胞上清外泌体，利用PBS重悬得到外泌体悬液；(2)miR150mimic的获取：人工合成miR
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150mimic，所述miR
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150mimic有效工作序列为3
’‑
GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU
‑5’
，其茎环序列为：CUCCCCAUGGCCCUGUCUCCCAACCCUUGUACCAGUGCUGGGCUCAGACCCUGGUACAGGCCUGGGGGACAGGGACCUGGGGAC；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俭，胡捷，张勇，张文帅，张翔宇，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：