一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法，首先通过光照降解OH11发酵液中副产物ATB，然后利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行静态吸附或动态吸附，解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得HSAF粗提物。本发明专利技术所述的方法工艺简单、操作性强、成本低廉，生产过程安全无污染，为其规模化生产提供参考。供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法


[0001]本专利技术属于微生物天然产物分离纯化
，具体涉及一种从产酶溶杆菌发酵液中选择性分离纯化抗真菌活性物质HSAF的方法。

技术介绍

[0002]热稳定抗真菌因子(Heat Stable Antifungal Factor,简称HSAF)是产酶溶杆菌产生的一种小分子抗真菌物质，具有热稳定性高、抗菌谱广及毒性低等特点。其对病原真菌的作用方式与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，主要通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。因此，HSAF具有被开发为一种新型杀菌剂的潜力。
[0003]作为一种新型的抗真菌活性物质，HSAF的研究一直受到全球关注，也取得了一些重要进展。但这些主要集中在生物合成基因及途径解析、调控因子鉴定、拮抗机理探究和发酵产量提升等方面，而关于HSAF的分离提取研究却少有进展。目前HSAF从发酵液中的分离纯化仍采用传统的乙酸乙酯萃取法，步骤繁多、消耗大量时间、劳力，大量使用毒性较大的有机溶剂(乙酸乙酯)，容易造成操作工人的身体健康危害和环境污染。而且ATB也是产酶溶杆菌产生代谢产物，与HSAF共存于OH11发酵液中，含量高达258.81mg/L，是HSAF发酵生产过程中的主要副产物，且由于具有与HSAF相似的结构和化学性质，极难通过常规的方法去除，严重影响最终HSAF的分离纯度(仅为8％左右)，根本无法满足研究要求。这也是限制其产业化生产的一个重要因素。因此有必要发展一种简单、经济、高效的提取方法来分离纯化发酵液中HSAF，加速推动HSAF后续的产业化工作。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的提供一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法，是一种安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护的提取HSAF的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0006]一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法，首先通过光照降解OH11发酵液中副产物ATB，然后利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行静态吸附或动态吸附，解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得HSAF粗提物。
[0007]本专利技术所述的产酶溶杆菌发酵液可以通过本领域的常规方法获得，例如但不限于：将活化好的产酶溶杆菌OH11菌株接入LB种子液中，过夜培养后，按照2～5％接种量转接发酵培养基中，置于摇床中发酵培养，得到HSAF发酵液；所用的发酵培养基可以为本领域常用的发酵培养基，例如：黄豆粉6.00～10.00g/L、葡萄糖7～8g/L，CaCl
2 0.65～0.80g/L；发酵培养基条件为25～30℃、160～200rpm、55～60h。
[0008]本专利技术所述的产酶溶杆菌发酵液没有特别要求，在一些实施例中，发酵液pH范围
为6-8，HSAF的浓度为200-500mg/L。
[0009]在一些实施例中，本专利技术利用光照降解OH11发酵液中副产物ATB具体为：将产酶溶杆菌发酵液置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000LX。本专利技术所述的光可以通过现有技术常规方法获得，例如直接太阳光照或者通过日光灯产生；本专利技术通过光照提前降解发酵液中的ATB，可以达到提高HSAF纯度的目的。
[0010]在本专利技术一种具体的实施例中，本专利技术大孔树脂选用孔径为20～22nm的NKA型大孔树脂。
[0011]在一些实施例中，本专利技术所述方法中的大孔树脂在用于吸附之前先进行预处理，本专利技术提供一种具体的预处理方法：将大孔树脂采用无水乙醇浸泡，除去上浮的树脂碎片，反复浸泡3-5次，至无白色浑浊为止，最后用去离子水清洗直至无乙醇气味，烘干后备用。
[0012]在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行静态吸附的具体方法为：将大孔树脂和发酵液一起加入容器中，密封后置于摇床上进行吸附，过滤分离树脂和滤液。
[0013]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，发酵液和大孔树脂的体积质量比为30-60ml：0.62g在一种具体的实施例中，为50ml：0.62g。
[0014]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附条件为120-200rpm、27-37℃、4-8h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、6h。
[0015]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，吸附公式为：
[0016][0017][0018]式中：q
e
—吸附容量，mg/g；E—吸附率，％；C0—起始浓度，mg/L；C
e
—平衡浓度，mg/L；V—发酵液体积，mL；W—干树脂重量，g。
[0019]当采用静态吸附时，在本专利技术的一种实施例中，本专利技术还提供静态吸附的解吸过程：对过滤收集的树脂用去离子水清洗，至表面无样品液残留，再用滤纸吸干水分，重新置于容器中，加入无水乙醇，密封后置于摇床中进行解吸。
[0020]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸时加入无水乙醇和大孔树脂的体积质量比为30-50mL：0.62g，优选50mL：0.62g。
[0021]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸条件为120-200rpm、27-37℃、0.5-3h，在一种具体的实施例中，为180rpm、37℃、2h。
[0022]在本专利技术一些实施例中，当进行静态吸附时，解吸公式：
[0023][0024][0025]式中：q
d
—解吸容量，mg/g；D—解吸率，％；C
d
—解吸液中HSAF浓度，mg/L；V
d
—解吸溶液体积，mL。
[0026]在一些实施例中，利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行动态吸附的具体方法为：将大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡后，将发酵液样品匀速上样，每隔一个柱体
积(BV)收集流出液，待流出液中HSAF浓度达到初始上样浓度的6～15％时，停止上样。
[0027]本专利技术大孔树脂湿法装入层析柱中，用去离子水平衡可以采用本领域常规的方法。
[0028]在本专利技术一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的HSAF进行吸附时发酵液的流速为1-2BV/h；在一种具体的实施例中，流速为2BV/h。
[0029]在本专利技术一些实施例中，当进行动态吸附时，上样量为15-28BV，优选20-22BV。
[0030]在本专利技术一些实施例中，当进行动态吸附时，大孔树脂对发酵液中的HSAF进行吸附的吸附容量为20mg/g～25mg/g。
[0031]当采用动态吸附时，在本专利技术的一种实施例中，本专利技术还提供动态吸附的解吸过程：已吸附饱和的树脂用去离子水洗至无样品液残留，采用两阶段洗脱程序进行解吸；第一阶段：用低浓度乙醇水溶液进行洗脱，去除吸附在树脂上的极性或中等极性化合物；第二阶段：用高浓度乙醇水溶液对HSAF进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化产酶溶杆菌发酵液中抗真菌活性物质HSAF的方法，其特征在于，首先通过光照降解OH11发酵液中副产物ATB，然后利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行静态吸附或动态吸附，解吸后的解吸液蒸发浓缩干燥后得HSAF粗提物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用可见光降解OH11发酵液中副产物ATB具体为：将产酶溶杆菌发酵液置于光照条件下照射1-5天，光照强度1000-20000LX。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大孔树脂选用孔径为20～22nm的NKA型大孔树脂。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行静态吸附的具体方法为：将大孔树脂和发酵液一起加入容器中，密封后置于摇床上进行吸附，过滤分离树脂和滤液；优选的，当进行静态吸附时，发酵液和大孔树脂的体积质量比为30-60ml：0.62g；更优选的，发酵液和大孔树脂的体积质量比为50ml：0.62g；优选的，当进行静态吸附时，吸附条件为120-200rpm、27-37℃、4-8h，更优选的为180rpm、37℃、6h。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当采用静态吸附时，静态吸附的解吸过程：对过滤收集的树脂用去离子水清洗，至表面无样品液残留，再用滤纸吸干水分，重新置于容器中，加入无水乙醇，密封后置于摇床中进行解吸；优选的，解吸时加入无水乙醇和大孔树脂的体积质量比为30-50mL：0.62g，更优选50mL：0.62g；优选的，解吸条件为120-200rpm、27-37℃、0.5-3h，更优选的为180rpm、37℃、2h。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用大孔树脂对发酵液中的HSAF进行动态吸附的具体方法为：将大孔树...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤宝，刘凤权，孙伟波，赵延存，徐会永，陈贤，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：