一种基于改良型DO-stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于改良型DO

【技术实现步骤摘要】
一种基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，尤其涉及一种基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法。

技术介绍

[0002]人粒细胞集落刺激因子(hGCSF)是一种造血细胞因子，作用于中性粒细胞谱系的细胞，能引起定向前体细胞的增殖和分化，并激活成熟中性粒细胞。由于其低分子量(18.8kDa)的特性，hGCSF可快速从血浆中清除，半衰期(t
1/2
)极短，仅为4
‑
8小时。为了解决这一问题，构建了重组毕赤酵母生产人血清白蛋白人粒细胞集落刺激因子(HSA
‑
GCSF
m
)融合蛋白的组成型表达载体，其具有较强的生物活性和较长的体内半衰期。但是，与HSA
‑
GCSF
m
融合蛋白生产过程优化的相关文献报道较少。
[0003]甲醇营养型毕赤酵母是一种表达外源蛋白的理想型的宿主。一般而言，重组毕赤酵母表达外源蛋白主要分成两个阶段：1)在细胞生长阶段，以甘油为唯一碳源在短时间内获得高密度的骨架完整、功能健全的细胞；2)在甲醇诱导阶段，通过流加甲醇诱导重组蛋白的高效表达。众所周知，甲醇诱导阶段的时间(70
‑
90h)远长于细胞生长阶段(20
‑
30h)。因此，开发一种有效的甲醇流加策略被认为是提高外源蛋白表达的关键问题。大量的甲醇流加策略已经被开发并应用于外源蛋白的高效表达，例如定速流加甲醇，甲醇ON
‑
OFF流加和DO
‑
stat流加甲醇等。在上述的甲醇流加策略中，在线DO
‑
stat和ON
‑
OFF反馈控制策略被认为优于其他控制策略，因为其在甲醇流加过程中可在线处理发酵过程参数的动态变化[Cos O,Ram
ó
n R,Montesinos JL,et al.Microb Cell Fact,2006,5:17]。然而，传统的DO
‑
stat流加策略通过在线测量的DO水平控制底物流加且(或)基于DO的持续震荡流加底物，这往往会导致碳源(甲醇)的匮乏[Jia LQ,Li T,Wu YX,et al.Appl.Microbiol.Biotechnol,2021,105:1041
‑
1050]。具体地说，采用DO
‑
stat流加策略时，毕赤酵母细胞对于甲醇的需求超出了甲醇的流加量，这意味着毕赤酵母细胞消耗甲醇受到了限制。另一方面，当采用ON
‑
OFF控制策略时，甲醇浓度被控制在4
‑
10g/L的充足水平会导致胞内有毒代谢物的积累[Gao MJ,Shi ZP.Chin J Chem Eng,2013,21:216
‑
226]。因此，细胞处于甲醇过剩(ON
‑
OFF控制)和匮乏(DO
‑
stat控制)的状态必须被考虑和解决。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提供一种基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，目的是提高甲醇消耗率和外源蛋白的表达，也可为毕赤酵母表达外源蛋白的过程控制提供一些有价值的信息。
[0005]基于上述目的，本专利技术提供了一种基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，所述方法包括当Mut
+
型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO
‑
stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10
‑
30％，甲
醇浓度控制在0
‑
2g/L。
[0006]作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO
‑
stat相结合策略进行甲醇流加控制，此方法将DO的震荡宽度控制在了狭窄且稳定的水平(～20％)，甲醇浓度在0
‑
1g/L。
[0007]作为一种优选的实施方式，所述在线指数和DO
‑
stat相结合策略是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甲醇流加速度的调控方法得到的。
[0008]所述调控方法是当细胞浓度达到预期目标且甘油完全耗尽时，开始进入甲醇流加阶段，利用DO电极在线测量DO浓度，预设DO浓度的设定值为20％，当测定浓度高于DO浓度的设定值时，停止甲醇流加；当测定浓度低于DO浓度的设定值时，启动甲醇流加。
[0009]所述甲醇的流加速度采用如下计算公式得到：
[0010][0011]其中，F
MeOH
是甲醇流加速度；DO是发酵液中溶解氧的实际浓度；DO
set
＝20％，DO
set
是发酵液中溶解氧的设定浓度；K
C
＝0.06，K
C
是比例参数；Y
X/S
＝0.37，Y
X/S
是细胞对甲醇的得率；μ
set
＝0.03l/h，μ
set
是细胞比生长速度的设定值；X
t0
＝80.0g/L，X
t0
是甲醇流加开始时的细胞浓度；t0是甲醇流加的开始时间；t
f
是甲醇流加的结束时间。
[0012]所述溶解氧浓度的控制方法为利用工控机和其内置的AD
‑
DA数据接口/转化卡，驱动程序可调式蠕动泵，以所述计算公式在发酵液中流加甲醇。
[0013]所述方法为将携带HSA
‑
GCSF
m
融合蛋白的Mut
+
型重组毕赤酵母接种到含有甘油初始培养基的发酵罐中，通过调整搅拌转速将DO控制在20％以上，保持温度30℃，pH＝6.0；当初始培养基中甘油被耗尽且DO急剧上升，采用DO
‑
stat控制策略用于甘油流加阶段的甘油流加，同时，控制发酵液pH为6.0，当细胞浓度达到～80g
‑
DCW/L且残留的甘油完全耗尽后，开始流加甲醇进入甲醇诱导阶段，在整个甲醇诱导阶段，空气和纯氧按需求用于曝气，温度和pH控制不变。
[0014]所述Mut
+
型重组毕赤酵母在初始发酵培养基中的接种量为初始发酵培养基总体积的15
‑
25％。
[0015]在发酵开始时，通气速度为3
‑
5vvm。
[0016]在整个发酵阶段，通过氨水和磷酸控制发酵液pH为6.0。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018](1)采用本专利技术的方法，胞内的有毒的代谢物(甲醇和甲醛)维持在了零水平。
[0019](2)采用本专利技术的方法，甲醇消耗/流加速度被明显提高了。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括当Mut
+
型重组毕赤酵母进入甲醇流加诱导阶段时，采用在线指数和DO
‑
stat相结合策略进行甲醇流加控制，以将DO的震荡宽度范围控制在10
‑
30％，甲醇浓度控制在0
‑
2g/L。2.根据权利要求1所述基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述在线指数和DO
‑
stat相结合策略是通过基于溶解氧电极在线监测溶解氧浓度进行调控甲醇流加速度的调控方法得到的。3.根据权利要求2所述基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述调控方法是当细胞浓度达到预期目标且甘油完全耗尽时，开始进入甲醇流加阶段，利用DO电极在线测量DO浓度，预设DO浓度的设定值为20％，当测定浓度高于DO浓度的设定值时，停止甲醇流加；当测定浓度低于DO浓度的设定值时，启动甲醇流加。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述基于改良型DO
‑
stat策略调控毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述甲醇的流加速度采用如下计算公式得到：其中，F
MeOH
是甲醇流加速度；DO是发酵液中溶解氧的实际浓度；DO
set
＝20％，DO
set
是发酵液中溶解氧的设定浓度；K
C
＝0.06，K
C
是比例参数；Y
X/S
＝0.37，Y
X/S
是细胞对甲醇的得率；μ
set
＝0.03l/h，μ
set
是细胞比生长速度的设定值；X
t0
＝80.0g...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾禄强，李天翼，王庆玲，李腾，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：