一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法技术

本发明专利技术的一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，包括如下步骤：步骤1，将伪结核棒状杆菌和马红球菌分别置LB培养基37℃培养后，通过离心机收获菌体；步骤2，将各菌体用灭菌生理盐水稀释到8.0

【技术实现步骤摘要】
一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法


[0001]本专利技术属于畜牧兽医学领域，具体涉及一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法。

技术介绍

[0002]马红球菌属放线菌目、诺卡菌科、红球菌属。该菌是一种革兰阳性兼性胞内寄生菌，菌落为粉色或黄色，棒状球形，耐酸，无孢子，大多无鞭毛，但有些菌株有菌毛或附肢。马红球菌的细胞壁具有疏水性且被多糖荚膜所围绕，其细胞壁的主要成分为富含霉菌酸(Mycolicacids)的脂质和脂多糖，其中脂多糖为海藻糖二甲酸酯(Trehalose dimycolate，TDM)和脂阿拉伯糖甘露聚糖(Lipoarabinomannans，LAM)。
[0003]马红球菌能够引起宿主巨噬细胞会经历NF
‑
κB的移位，并通过Toll样受体2(TLR2)激活多种促炎介质产生，例如肿瘤坏死因子(TNF
‑
α)、白细胞介素
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12(IL
‑
12)以及一氧化氮(NO)。低剂量的马红球菌强毒株会使马驹对马红球菌产生较强的Th1免疫反应；在成年马中，马红球菌引起IFN
‑
γ产生为特征的Th1反应，活化的巨噬细胞和树突状细胞产生的IL
‑
12也会刺激Th0细胞分化为Th1细胞。这些试验表面马红球菌具备活化机体免疫系统能力，具有成为疫苗佐剂的潜质。
[0004]伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)为革兰氏阳性兼性细胞内病原菌，属于放线菌属。该菌为兼性厌氧，其细胞中含有霉菌酸，呈多形形式，不形成孢子或芽孢，不运动，具有菌毛。该菌有如下特征，细胞壁的组织，细胞壁主要由肽聚糖、阿拉伯糖醛酸和菌根酸组成；(2)基因组G+C含量较高(47
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74％)。
[0005]伪结核棒状杆菌引起IL
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1β和TNF
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α表达水平显著升高。IL
‑
1β是非常重要的促炎性反应细胞因子，在局部和全身的感染和损伤中起着核心的作用；TNF
‑
α在宿主抵抗伪结核棒状杆菌的感染中起着重要的作用，它是一种先天性免疫应答的重要的炎性介质，具有诱导产生细胞因子、激活表达粘附分子和生长刺激、引起炎症反应抵抗感染和免疫调节的作用。
[0006]伪结核棒状杆菌中的PLD基因，也可以激活补体，促进中性粒细胞的分化。鉴于伪结核棒状杆菌对机体免疫系统的激活作用，利用伪结核棒状杆菌作为佐剂，提升灭活疫苗的免疫效果，理论上是可行的。
[0007]目前常用的的疫苗佐剂，例如白油佐剂，通常会引起局部刺激反应，存在诱导免疫应答弱，免疫增强效果差的缺点，限制了疫苗佐剂的使用，因此，需要开发新一代高效、低毒、廉价的疫苗佐剂。

技术实现思路

[0008]因此，本专利技术提供一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1，将伪结核棒状杆菌和马红球菌分别置LB培养基37℃培养后，通过离心机收
获菌体；
[0010]步骤2，将各菌体用灭菌生理盐水稀释到8.0
×
109cfu/mL，对菌液采用高压匀质仪破碎；
[0011]步骤3，经无菌检验后，将伪结核棒状杆菌和马红球菌的裂解产物按照1:1比例与甲醛灭活的两种菌体混合，得到添加有佐剂的灭活疫苗。
[0012]优选的，步骤2中，对菌液采用高压匀质仪破碎三次。
[0013]优选的，步骤3中，对灭活疫苗进行物理性状检验、无菌检验、甲醛残留量检验，同时进行灭活疫苗保护效率试验，检测疫苗安全性及保护效力；疫苗通过物理性状检验、无菌检验、超标检验及超剂量免疫安全性检查、效力检查，最终2
‑
8℃保存。
[0014]优选的，所述离心机包括：箱体、电机、第一转轴、第一齿轮、第二转轴、第二圆盘、第二齿轮、支撑板，
[0015]所述箱体的内壁底部设置有电机，所述电机的输出轴向上与竖直方向的第一转轴一端连接，第一转轴另一端与第一圆盘同轴连接，所述第一转轴上设置有第一齿轮，所述箱体的内壁底部设置有竖直方向的第二转轴，所述第二转轴一端与所述箱体的内壁转动连接，所述第二转轴另一端上设置有第二圆盘，所述第二转轴上设置有第二齿轮，所述第一齿轮与所述第二齿轮直径相等且相啮合，所述箱体内设置有水平方向的支撑板，所述第一转轴和所述第二转轴均穿过所述支撑板，并与所述支撑板转动连接，所述支撑板位于第一齿轮和第一圆盘之间；
[0016]所述第一圆盘和第二圆盘的直径相等，所述第一圆盘上设置有第一偏心柱，所述第二圆盘上设置有第二偏心柱，所述第一偏心柱和第二偏心柱对称设置，所述第一偏心柱顶端转动连接有第一滑块，所述第二偏心柱上端设置有连杆，所述连杆一端与所述第二偏心柱上端转动连接，所述连杆另一端穿过所述第一滑块，并与所述第一滑块滑动连接，所述第一滑块顶端设置有水平方向的导向口，连接柱一端与所述连杆连接，连接柱另一端穿过所述导向口与工作台连接，所述工作台顶端设置有若干放置槽。
[0017]优选的，所述工作台顶端设置有盖子，所述盖子与所述工作台螺纹连接。
[0018]优选的，所述连杆远离所述第二偏心柱的一端设置有限位块。
[0019]优选的，所述箱体顶端设置有箱门，所述箱门一端与所述箱体顶端铰接。
[0020]优选的，所述箱体的侧壁上设置有若干散热孔。
[0021]优选的，所述高压匀质仪包括：筒体、推板、固定管、第一连接杆、开口、滑管、第二连接杆、第三连接杆，
[0022]所述筒体的内壁顶部设置有电动推杆，所述电动推杆的输出端向下与推板连接，所述推板的下方设置有竖直方向的固定管，所述固定管的外壁与所述筒体的内壁通过第一连接杆连接，所述固定管外壁的左右两侧分别设置有竖直方向的开口，所述固定管内设置有滑管，所述滑管能在所述固定管内上下往复运动，所述滑管两端设置有水平方向的第二连接杆，所述第二连接杆一端与所述滑管外壁连接，所述第二连接杆另一端穿过所述开口与第三连接杆一端垂直连接，第三连接杆另一端与所述推板底端连接；
[0023]所述滑管内设置有转管，所述转管的外壁上设置有螺旋滑槽，所述转管内壁设置有滑柱，所述滑柱能在所述螺旋滑槽内滑动，所述转管底端延伸出所述滑管与转板连接，所述固定管下端的内壁上间隔分别设置有第一环形滑槽和第二环形滑槽，所述第一环形滑槽
和所述第二环形滑槽之间通过竖直槽连通，所述转板的左右两侧分别设置有第二滑块，所述第二滑块能在所述竖直槽内上下往复滑动，也能在所述第一环形滑槽和所述第二环形滑槽内旋转，所述固定管的下方设置有水平方向的隔板，所述隔板与所述筒体内壁连接，所述隔板上设置有轴孔，所述转板的底端与第三转轴一端连接，第三转轴另一端穿过所述轴孔与切割刀连接，所述筒体的下端外壁上分别设置有进液管和出液管。
[0024]优选的，所述进液管和所述出液管上均设置有高压阀。
[0025]本专利技术技术方案具有以下优点：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将伪结核棒状杆菌和马红球菌分别置LB培养基37℃培养后，通过离心机收获菌体；步骤2，将各菌体用灭菌生理盐水稀释到8.0
×
109cfu/mL，对菌液采用高压匀质仪破碎；步骤3，经无菌检验后，将伪结核棒状杆菌和马红球菌的裂解产物按照1:1比例与甲醛灭活的两种菌体混合，得到添加有佐剂的灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，对菌液采用高压匀质仪破碎三次。3.根据权利要求1所述的一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，对灭活疫苗进行物理性状检验、无菌检验、甲醛残留量检验，同时进行灭活疫苗保护效率试验，检测疫苗安全性及保护效力；疫苗通过物理性状检验、无菌检验、超标检验及超剂量免疫安全性检查、效力检查，最终2
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8℃保存。4.根据权利要求1所述的一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，所述离心机包括：箱体(1)、电机(2)、第一转轴(3)、第一齿轮(4)、第二转轴(5)、第二圆盘(6)、第二齿轮(7)、支撑板(8)，所述箱体(1)的内壁底部设置有电机(2)，所述电机(2)的输出轴向上与竖直方向的第一转轴(3)一端连接，第一转轴(3)另一端与第一圆盘(17)同轴连接，所述第一转轴(3)上设置有第一齿轮(4)，所述箱体(1)的内壁底部设置有竖直方向的第二转轴(5)，所述第二转轴(5)一端与所述箱体(1)的内壁转动连接，所述第二转轴(5)另一端上设置有第二圆盘(6)，所述第二转轴(5)上设置有第二齿轮(7)，所述第一齿轮(4)与所述第二齿轮(7)直径相等且相啮合，所述箱体(1)内设置有水平方向的支撑板(8)，所述第一转轴(3)和所述第二转轴(5)均穿过所述支撑板(8)，并与所述支撑板(8)转动连接，所述支撑板(8)位于第一齿轮(4)和第一圆盘(17)之间；所述第一圆盘(17)和第二圆盘(6)的直径相等，所述第一圆盘(17)上设置有第一偏心柱(9)，所述第二圆盘(6)上设置有第二偏心柱(10)，所述第一偏心柱(9)和第二偏心柱(10)对称设置，所述第一偏心柱(9)顶端转动连接有第一滑块(11)，所述第二偏心柱(10)上端设置有连杆(12)，所述连杆(12)一端与所述第二偏心柱(10)上端转动连接，所述连杆(12)另一端穿过所述第一滑块(11)，并与所述第一滑块(11)滑动连接，所述第一滑块(11)顶端设置有水平方向的导向口(13)，连接柱(14)一端与所述连杆(12)连接，连接柱(14)另一端穿过所述导向口(13)与工作台(15)连接，所述工作台(15)顶端设置有若干放置槽(16)。5.根据权利要求4所述的一种以细菌裂解物作为灭活疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，所述工作台(15)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴龙，黄志鑫，李哲，李旭鑫，张静雅，郑玉清，谢宏林，黄歆然，李慧，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：