使用FACS分离胎儿细胞制造技术

本发明专利技术涉及用于从来自孕妇的样品例如血液样品中分离胎儿细胞的自动化方法。分离的胎儿细胞可用于识别胎儿DNA中的遗传异常。儿细胞可用于识别胎儿DNA中的遗传异常。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用FACS分离胎儿细胞


[0001]本专利技术涉及用于从来自孕妇的血液样品中分离胎儿细胞的自动化方法。分离的胎儿细胞可用于识别胎儿DNA中的遗传异常。

技术介绍

[0002]在妊娠期间，来自胎盘的胎儿细胞会侵入母体血液循环。这些胎儿细胞大多起源于胎盘，是滋养层细胞、血管内滋养层细胞或绒毛外滋养层细胞(EVT)。这些侵入母体循环的胎儿细胞显示出内皮和上皮特征。上皮滋养层细胞改变特征并侵入母体循环的过程称为上皮
‑
间充质转化(EMT)。
[0003]EMT是上皮细胞逐渐失去其上皮特征并获得间充质样表型的过程。EMT在早期胚胎形成中已有描述，其中胚胎上皮细胞的迁移和瞬时去分化是形成神经管等所必需的。
[0004]通过利用中胚层标记物(即内皮标记物)作为阳性选择标记物，母体血液样品中存在的极少量的胎儿细胞与一些母体细胞一起被富集。随后通过使富集的细胞与上皮标记物接触从而利用EMT现象来对胎儿细胞进行阳性识别。血液样品中存在的正常母细胞均未表达任何上皮标记物。
[0005]在图2A所示的现有技术方法中，母体血液样品经过处理，然后进行富集，以去除大部分母体细胞。随后，用荧光标记的母体和胎儿标记物对细胞进行染色，并在载玻片上进行扫描。考虑到母体血液样品中胎儿细胞的出现率极低，后一个过程既繁琐又耗时。

技术实现思路

[0006]在一个方面，本专利技术涉及一种从孕妇的生物样品中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括步骤：
[0007]a.提供来自所述孕妇的生物样品，该生物样品包含细胞组分，
[0008]b.使所述细胞组分中包含的细胞与针对至少一种胎儿细胞上皮标记物和/或内皮标记物的一种或多种荧光标记剂接触，
[0009]c.基于与细胞结合的所述一种或多种荧光标记剂的检测，通过荧光激活细胞分选法(FACS)分选所述细胞，和
[0010]d.在所述分选细胞中识别胎儿细胞，包括将胎儿来源分类器分配给各个分选细胞的步骤。
[0011]本专利技术人做出了令人惊讶的观察，即可以使用FACS进行单细胞分选，随后通过简单地分析FACS输出，结合大量参数(例如散射和来自一个或多个荧光标记抗体的信号)来识别具有高胎儿概率的细胞。该输出可以组合到分类器中，其可以是数字分数或二元的。使用本专利技术的方法，专利技术人开发了一种以很高的可能性在分选细胞中识别胎儿细胞的方法。
[0012]与现有技术方法相比的优点如图1中所示，主要优点在于该过程可以完全自动化并且不需要拾取被识别为可能的胎儿细胞的细胞。
[0013]被识别的细胞可通过遗传分析确认为胎儿细胞，并可进一步用于识别细胞中的遗
传异常。
[0014]在另一方面，本专利技术涉及一种确定胎儿遗传异常的方法，所述方法包括步骤：
[0015]a.获得通过本专利技术的方法分离的一种或多种胎儿细胞，和
[0016]b.检测与所述胎儿细胞基因组中的所述遗传异常相关的一种或多种遗传标记物。
附图说明
[0017]图1
[0018]使用FACS富集和分离胎儿细胞的基本原理。A)＝此步骤后的胎儿细胞访问很费力且使过程通量低。B)＝此步骤后的胎儿细胞访问速度较快，母体细胞污染风险更低。不过仍然需要人为干预。C)＝没有对胎儿细胞的物理拾取。每96孔板1个细胞，然后进行单细胞分析。
[0019]图2
[0020]不使用FACS(A)和使用FACS(B)的胎儿细胞富集
[0021]A.1和B.1＝采样，A.2和B.2＝血液处理，A.3和B.3＝选择、富集和染色，A4和B.5＝扫描、和“拾取”胎儿细胞，B.4＝FACS。
[0022]图3
[0023]Alexa Fluor 488(X轴)(CK抗体)和PE(Y轴)(CD14+CD45)的FACS图上门1(Gate 1)的X和Y坐标。五个坐标中连接对角线的两个不是固定的，而是在x和y轴上有一个范围。
[0024]图4
[0025]使用FACS进行单细胞分选并使用STR分析法对它们进行分析。A)＝采样，B)＝血液处理，C＝选择、富集和染色，D)＝FACS和E)＝ABI 3500(STR分析)
[0026]图5
[0027]Alexa Fluor 488(X轴)(CK抗体)和PE(Y轴)(CD14+CD45)的FACS图上门G7的X和Y坐标。门G7用于在各个管中各自分选单细胞。
[0028]图6
[0029]对单分选的细胞进行STR分析的编译数据。图中的百分比是每个样品的各自百分比的平均值。A)＝母体细胞，B)＝胎儿细胞，C)＝胎儿+母体细胞，D)＝空，E)＝其他污染
[0030]图7
[0031]使用FACS进行单分选细胞之后，对胎儿细胞进行富集、识别和分析的完整实施流程。A)＝采样，B)＝血液处理，C＝选择、富集和染色，D)＝FACS，E)＝全基因组扩增(WGA)，F)＝ABI 3500(STR分析)和G)＝阵列比较基因组杂交。
[0032]图8
[0033]门控策略。A)所有事件，FSC
‑
A(X轴)和SSC
‑
A(Y轴)。排除了具有高SSC值的事件(碎片)。B)低SSC事件，FSC
‑
A(X轴)和Hoechst(Y轴)。然后对剩余的细胞进行门控以获得Hoechst
+
细胞。C)Hoechst事件，AF488(X轴)和AF555(Y轴)。从Hoechst
+
组分中，对CK+CD45
‑
CD14
‑
细胞进行单细胞分选。
[0034]图9
[0035]第一次分选的门控策略。A)所有事件，FSC
‑
A(X轴)和SSC
‑
A(Y轴)。排除了具有高SSC值的事件(碎片)。B)低SSC事件，FSC
‑
A(X轴)和Hoechst(Y轴)。然后对剩余的细胞进行门
控以获得Hoechst
+
细胞。C)Hoechst事件，AF488(X轴)和AF555(Y轴)。从Hoechst
+
组分中，CK
中
‑
至
‑
高
CD45
‑
CD14
‑
细胞被批量分选作为富集步骤。
[0036]图10
[0037]第二次分选的门控策略。A)所有事件，FSC
‑
A(X轴)和SSC
‑
A(Y轴)。排除了具有高SSC值的事件(碎片)。B)低SSC事件，FSC
‑
A(X轴)和Hoechst(Y轴)。然后将剩余的细胞门控以获得Hoechst
+
细胞。C)Hoechst事件，AF488(X轴)和AF555(Y轴)。从Hoechst
+
组分中，对CK
高
CD45
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产前诊断方法，包括步骤：1.提供怀有胎儿的妇女的血液样品，2.使所述血液样品中包含的细胞与至少一种针对胎儿滋养层细胞标记物的磁性标记剂接触，3.用磁激活细胞分选法(MACS)富集所述样品以获得胎儿滋养层细胞，4.使富集的细胞与选自以下各组的至少一种荧光标记剂接触：i.针对细胞核的荧光标记剂，ii.针对母体细胞标记物的荧光标记剂，和iii.针对胎儿滋养层细胞标记物的荧光标记剂5.在荧光激活细胞分选仪(FACS)上对所述富集的样品中的荧光标记细胞进行单细胞分选，基于：i.所述针对胎儿滋养层细胞标记物的荧光标记剂的阳性选择，ii.所述针对细胞核的荧光标记剂的阳性选择，和iii.所述针对母体细胞标记物的荧光标记剂的阴性选择6.识别所述分选细胞中的胎儿滋养层细胞，包括通过从单个分选细胞获得基因型，将胎儿起源分类器分配给各个分选细胞的步骤，和7.诊断胎儿的表型。2.一种产前诊断方法，包括步骤：1.提供怀有胎儿的妇女的血液样品，2.使所述血液样品中包含的细胞与选自以下各组的至少一种荧光标记剂接触：i.针对细胞核的荧光标记剂，ii.针对母体细胞标记物的荧光标记剂，和iii.针对胎儿滋养层细胞标记物的荧光标记剂3.基于所述荧光标记剂的荧光，在荧光激活细胞分选仪(FACS)上富集所述样品以获得胎儿滋养层细胞，4.在FACS上对所述富集的样品中的荧光标记细胞进行单细胞分选，基于：i.所述针对胎儿滋养层细胞标记物的荧光标记剂的阳性选择，ii.所述针对细胞核的荧光标记剂的阳性选择，和iii.所述针对母体细胞标记物的荧光标记剂的阴性选择5.识别所述分选细胞中的滋养层细胞，包括通过从所述胎儿滋养层细胞获得基因型，将胎儿起源分类器分配给各个分选细胞的步骤，和6.诊断胎儿的表型。3.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述针对胎儿滋养层细胞标记物的磁性和/或荧光标记剂是针对内皮或上皮标记物的磁性和/或荧光标记剂。4.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述针对胎儿滋养层细胞标记物的磁性和/或荧光标记剂是针对内皮标记物的磁性和/或荧光标记剂。5.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述内皮标记物选自Thy
‑
1CD90、血栓调节蛋白CD141、人内皮糖蛋白CD105、人波形蛋白(Vim)、血管细胞粘附分子(VCAM)、细胞间粘附分子1(ICAM)、血管内皮生长因子受体1(Flt
‑
1)(VEGFR
‑
1)，血管内皮生长因子受体2
(VEGFR
‑
2)、血管内皮生长因子受体3(VEGFR
‑
3)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI
‑
1)、内皮蛋白C受体(EPCR)、CD146、ITGA5、ITGB5、CDH11、CDH3和/或CD59。6.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述内皮标记物是CD105、CD90和/或CD141。7.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述内皮标记物是CD105和/或CD141。8.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述针对胎儿滋养层细胞标记物的磁性和/或荧光标记剂是针对上皮标记物的磁性和/或荧光标记剂。9.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述上皮标记物是细胞角蛋白。10.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述上皮标记物是细胞角蛋白，例如人细胞角蛋白1CK1、人细胞角蛋白2CK2、人细胞角蛋白3CK3、人细胞角蛋白4CK4、人细胞角蛋白5CK5、人细胞角蛋白6CK6、人细胞角蛋白7CK7、人细胞角蛋白8CK8、人细胞角蛋白9CK9，人细胞角蛋白10CK10、人细胞角蛋白13CK13、人细胞角蛋白14CK14、人细胞角蛋白15CK15、人细胞角蛋白16CK16、人细胞角蛋白17CK17、人细胞角蛋白18CK18、人细胞角蛋白19CK19。11.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述上皮标记物是细胞角蛋白、人细胞角蛋白7CK7、人细胞角蛋白8CK...

【专利技术属性】
技术研发人员：博莱特，
申请(专利权)人：阿塞迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：