一种产酸菌JC-H及其应用与产酸菌JC-H的培养、鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种产酸菌JC

【技术实现步骤摘要】
一种产酸菌JC
‑
H及其应用与产酸菌JC
‑
H的培养、鉴定方法


[0001]本专利技术属于环境微生物
，涉及一种产酸菌JC
‑
H及其应用，还涉及该产酸菌JC
‑
H的培养、鉴定方法。

技术介绍

[0002]矿产资源是人类生产、生活以及社会经济快速发展的物质基础，也是保障国家安全、维护国家发展利益的战略性资源。但是，不合理的开采会造成开采区及周围自然环境的极大破坏，每年的金属及非金属尾矿排放量达3亿吨，尾矿的累积堆存量近200亿吨。矿区中尾矿、废渣堆积在自然环境中，使尾矿中重金属渗透到土壤环境中的种类和数量也随之增多，不断向周边环境释放重金属，给当地自然生态环境和生产生活带来了较大的生态健康风险。近年来，我国发生的重金属污染事件也是屡见不鲜，如血铅事件、镉米事件等问，也使得重金属污染越来越受到广泛关注。
[0003]当前针对矿区重金属污染土壤资源进行修复的过程中，主要使用的是物理修复、化学修复和生物修复。在实际修复过程中：物理方法主要有换土客土、热处理法、电动修复等方法，然而物理方法一般需要花费大量的人力、物力、财力等，且一般仅限于小面积的重金属污染处理；化学方法主要有浸提、改良剂固定化、沉淀、离子交换等方法，化学修复方法虽然操作简单，也可以原位修复，但普遍会带来二次污染，甚至破坏土壤结构，且耗费较大。因此，这几种方法在技术上、经济上难以实现，也难以为公众所接受，面对大规模的重金属污染更是难以应用。而生物修复生物方法被认为是环境重金属污染治理的最具前景的新方法，重金属的生物修复就是利用生物作用，削减、净化环境中的重金属或降低重金属的毒性。
[0004]迄今为止，微生物修复正在引起国内外专家的关注，所以研究利用微生物修复矿区重金属污染土壤具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种产酸菌JC
‑
H及其应用与产酸菌JC
‑
H的培养、鉴定方法，为生物产酸并改良尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是，一种产酸菌JC
‑
H，该菌株命名为：黑曲霉(Aspergillus niger)JC
‑
H，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21424。
[0007]产酸菌JC
‑
H的培养方法，具体为：
[0008]步骤1、菌株的分离培养
[0009]采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
[0010]制备查式培养基：将蔗糖30g、NaNO
3 3g、K2HPO
4 1g、KCl 0.5g，FeSO4·
7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；
[0011]将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3
‑
5d；
[0012]步骤2、鉴别产酸菌株
[0013]制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
[0014]将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落，划线培养于产酸鉴别培养基；
[0015]培养3
‑
5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑选具有产酸能力的菌株多次接种于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
[0016]当添加重金属的查式培养基中，添加Zn
2+
浓度≤300mg/L，或Pb
2+
浓度≤2000mg/L，或Cd
2+
浓度≤300mg/L对产酸菌JC
‑
H的产酸效果基本无影响。
[0017]产酸菌JC
‑
H在产酸中的应用，利用发酵培养基测定产酸菌JC
‑
H的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100g，NaNO
3 1.5g，KH2PO
4 0.5g，KCl 0.025g，MgSO4·
7H2O 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节pH为6，于121℃灭菌20min；
[0018]向培养后产酸菌JC
‑
H培养基中加入无菌水，用无菌涂布棒，轻轻刮菌落表面，获得菌株孢子，再通过血球计数板观察孢子数量，加无菌水，将菌株孢子稀释，按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基，于30℃、160rpm的转数下在恒温振荡培养箱中进行培养。
[0019]产酸菌JC
‑
H的鉴定方法，包括：利用18S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵液中有机酸含量的测定。
[0020]利用18S rRNA基因序列对菌种鉴定具体为：
[0021]目标菌株18S rRNA基因序列的PCR扩增：
[0022]通过真菌通用引物ITS1(5
′‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3′
)和ITS4(5
′‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3′
)进行PCR扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的18SrRNA基因序列。
[0023]发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
[0024]首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下NaOH用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。
[0025]本专利技术的有益效果是：
[0026]产酸菌JC
‑
H的耐重金属效果：
[0027]当添加重金属的查式培养基中，采用打孔器接菌的方式，于30℃培养真菌，观察其菌株抑制率。抑制率(％)＝(空白平板直径
‑
重金属平板直径)/(空白直径
‑
3mm)。当添加重金属Zn
2+
浓度高于300mg/L，或Pb
2+
浓度高于2000mg/L，或Cd
2+
浓度高于300mg/L时，才会对产酸菌JC
‑
H产生严重抑制作用。
[0028]产酸菌JC
‑
H的耐重金属胁迫的产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产酸菌JC
‑
H，其特征在于，该菌株命名为：黑曲霉(Aspergillus niger)JC
‑
H，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21424。2.根据权利要求1所述的产酸菌JC
‑
H的培养方法，其特征在于，具体方法为：步骤1、菌株的分离培养采集受重金属污染严重的土壤作为样品；制备查式培养基：将蔗糖30g、NaNO
3 3g、K2HPO
4 1g、KCl 0.5g，FeSO4·
7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3
‑
5d；步骤2、鉴别产酸菌株制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的鉴别培养基备用，其颜色为紫色；将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；培养3
‑
5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株。3.根据权利要求1所述的产酸菌JC
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H在产酸中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用发酵培养基测定产酸菌JC
‑
H的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100g，NaNO
3 1.5g，KH2PO
4 0.5g，KCl 0.025g，MgSO4·
7H2O 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节pH为6，于121℃灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：西安文理学院，
类型：发明
国别省市：