猪圆环病毒3型Cap重组蛋白、其编码基因及在ELISA抗体检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白、其编码基因及在ELISA抗体检测中的应用，本发明专利技术采用PCR方法将PCV3 Cap基因中表达第60

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒3型Cap重组蛋白、其编码基因及在ELISA抗体检测中的应用
[0001]本申请是申请号为“201910046124.6”、申请日为“2019年1月18日”、专利技术名称为“猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及其编码基因和应用”的专利技术创造的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及编码该蛋白的基因，还涉及采用所得的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白进行PCV3间接ELISA抗体检测的应用。

技术介绍

[0003]猪圆环病毒病由猪圆环病毒引起，猪圆环病毒(PCV)分为三个血清型，PCV1、PCV2以及PCV3。普遍认为PCV1对动物没有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是 PCV2，PCV2对养猪业造成的危害十分严重，可以引起圆环病毒相关疾病(PCVAD)，造成免疫抑制。PCV2主要有两个阅读框：ORF1和ORF2，ORF1表达Rep蛋白和剪切体Rep
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，ORF2编码病毒的Cap蛋白，Cap蛋白构成病毒核衣壳的主要成分，是病毒的主要结构蛋白，决定病毒的抗原性，还可以自我组装形成病毒样颗粒。ORF2基因是疫苗开发和病原检测主要的靶蛋白，同时也是各亚型之间存在主要差异的基因。2016年美国学者Rachel Palinski等报道了一种新型病毒PCV3，随后该病毒在亚洲、美洲、欧洲等很多国家和地区出现。PCV3基因组长 2000bp，ORF1编码Rep蛋白，长度297aa(氨基酸)，ORF2编码Cap蛋白，长度214aa(氨基酸)。PCV3可以引起PDNS，并且表现出与PCV2类似的繁殖障碍、多系统性炎症等症状。湛洋对PCV3 Cap蛋白结构进行了分析，发现其与PCV2 Cap蛋白结构不存在共同的线性表位。还有研究表明，PCV3 ORF2基因和PCV2的ORF2基因表现出较大的差异，同源性仅37％左右，因此预测，PCV2疫苗对PCV3可能没有交叉保护作用。
[0004]基于以上原因，目前PCV2疫苗以及PCV2的检测方法都不能直接适用于PCV3，需要针对 PCV3ORF2基因的特异性研究适合它的检测方法和疫苗。临床上常使用血清学监测的方法了解抗体或者病原在动物体内的分布情况。间接免疫荧光实验和免疫过氧化物酶单层细胞试验操作复杂，成本昂贵，对设备要求高，不适用于临床大规模检测。ELISA方法不仅可以简便地对猪群感染情况进行监测，还可以用于评价疫苗的免疫效果，在ELISA方法中，包被抗原的浓度及纯度是影响检测结果敏感性和特异性的关键，因此研究PCV3 Cap蛋白的可溶性表达及纯化，得到适合于PCV3检测的ELISA方法具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因，该编码基因是将PCV3 ORF2(开放式阅读框)基因的表达第1
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120位氨基酸或第60
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120位氨基酸的基因片段删除后得到的，该基因成功实现了猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的可溶性表达，即实现了 PCV3 Cap重组蛋白的可溶性表达。
[0006]PCV ORF2基因编码Cap蛋白，Cap蛋白是该病毒的重要结构蛋白，决定了病毒的抗
原性，是疫苗免疫靶向的主要抗原。大肠杆菌表达系统具有目的蛋白表达效率高、操作简单、成本低等特点，其缺点是目的基因性质容易影响载体的表达，特别是目的基因的跨膜区、信号肽，可能使目的蛋白无法表达。本专利技术经过研究，通过将疏水性较强、抗原性较弱的PCV3 ORF2 基因的表达第1
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120位氨基酸或第60
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120位氨基酸的基因片段截短，实现了目的蛋白高效表达，而且，目的蛋白呈可溶性表达。目的蛋白基因的末端融合表达His标签，可利于采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。
[0007]进一步的，本专利技术猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因是将PCV3 ORF2基因中表达第1
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120位氨基酸片段或第60
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120位氨基酸片段的基因片段删除而得。该猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的基因序列，SEQ ID NO.1 是表达截短第1
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120位aa(氨基酸)片段的序列，SEQ ID NO.2是表达截短第60
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120位aa 的序列。
[0008]进一步的，本专利技术还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述的猪圆环病毒3型Cap 重组蛋白的编码基因。优选的，该重组质粒是由上述猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因和pET32a载体重组而得。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白，该重组蛋白呈可溶性表达，可与His标签抗体结合，便于纯化和制备。该重组蛋白与猪圆环病毒3型Cap蛋白相比缺少了第1
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120位aa或缺少了第60
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120位aa。
[0010]进一步的，该猪圆环病毒3型Cap重组蛋白由上述重组质粒表达而得。具体的，是通过将上述重组质粒转化至Rosseta感受态细胞，然后IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β
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D
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Thiogalactoside)诱导表达而得。
[0011]进一步的，该猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4 所示。其中，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列是缺失第1
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120位aa的氨基酸序列，SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列是缺失第60
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120位aa的氨基酸序列。
[0012]进一步的，纯化的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的制备方法如下：
[0013](1)将重组质粒转化至Rosseta感受态细胞，挑取单菌落接种到5～10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；
[0014](2)以1:100的体积比将步骤(1)培养得到的LB液体培养基接种到新的LB培养基中，当OD
600
值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，于37℃条件下培养4h，得培养液；
[0015](3)将所得培养液离心，收集菌体，所得菌体使用PBS重悬后进行超声波裂解，离心收集上清液，即得猪圆环病毒3型Cap重组蛋白；
[0016](4)使用亲和层析的方法纯化所得猪圆环病毒3型Cap重组蛋白，得纯化的猪圆环病毒 3型Cap重组蛋白。
[0017]本专利技术的另一目的是提供一种PCV3猪多克隆抗体，该PCV3猪多克隆抗体按照下述方法制得：
[0018](1)以纯化的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白为抗原，用其对猪进行免疫，每隔3周加强免疫一次；
[0019](2)待猪血清中抗体的效价大于1:10000时取猪血，分离血清，将血清离心后取上清液，即为PCV3猪多克隆抗体。
[0020]进一步的，制备P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因，其特征是：将PCV3 ORF2基因中表达第60
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120位氨基酸的基因片段删除而得。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因，其特征是：该基因的序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组质粒，其特征是：含有权利要求1或2所述的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因；优选的，所述重组质粒由权利要求1或2所述的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因和pET32a载体重组而得。4.一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白，其特征是：由权利要求3所述的重组质粒表达而得；优选的，所述猪圆环病毒3型Cap重组蛋白通过将权利要求3所述的重组质粒转化至Rosseta感受态细胞，然后IPTG诱导表达而得。5.根据权利要求4所述的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.一种PCV3猪多克隆抗体，其特征是按照下述...

【专利技术属性】
技术研发人员：白娟，李勇，姜辰龙，姜平，周而璇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：