一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法、传感器及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，包括以下步骤：(1)将细菌悬液滴加在电化学传感器的工作电极表面并孵育；(2)将Pt/Ni@GO纳米片滴加至(1)处理后的工作电极表面并孵育；(3)将电化学传感器的工作电极、参比电极和对电极连接到电化学工作站上，用磷酸缓冲液作为反应基底液，进行i

【技术实现步骤摘要】
一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法、传感器及其制备方法


[0001]本专利技术涉及电化学免疫传感器
，具体而言，涉及一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法、传感器及其制备方法。

技术介绍

[0002]由于抗生素的滥用，人类极有可能进入后抗生素时代，超级细菌的出现对人类的威胁逐渐严重，所以细菌的快速灵敏检测尤为重要。临床常用的细菌检测方法如革兰氏染色法、药敏检测、PCR、ELISA、飞行时间质谱检测等技术具有较高的特异性，但仍存在耗时、费用昂贵、交叉污染等缺点。
[0003]生物传感技术，如荧光、化学发光、电化学、电化学发光等，可以利用新的信号放大策略和纳米材料提高检测灵敏度，缩短检测时间。其中，电化学生物传感方法以其操作简便、制备简单、灵敏度高等优点，在细菌检测中得到了广泛的研究。
[0004]传统的细菌电化学免疫传感器大多通过抗体或适体基于三明治结构组建，电化学免疫传感器大多需要二抗的修饰，这不仅增加了实验过程的复杂化，而且极大增加了实验成本。
[0005]酶是一种高效的生物体催化剂，具有独特的选择性，能对特定的第五分子显示识别能力而成为许多电化学生物传感器的常用媒介体。虽然酶传感器具有灵敏度高、选择性好、响应快等特点，可是基于酶修饰的电化学传感器存在许多缺陷，酶传感器的制备过程非常复杂，且酶作为具有活性的生物大分子，对外界条件的变化比较敏感，容易失活变性，影响传感器的寿命和测定结果的准确性。
[0006]因此，需要研究一种无酶、不使用二抗、操作简便且稳定性高的革兰氏阴性菌检测方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一个目的在于提供一种革兰氏阴性细菌的电化学分析方法，其能够不使用二抗和酶对革兰氏阴性细菌进行精准高效的检测；
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种用于革兰氏阴性细菌的电化学传感器，能够有效的捕获靶细菌，电导性好，有利于后续的电化学检测；
[0009]本专利技术的第三个目的在于提供上述电化学传感器的制备方法，制备得到的传感器具有上述优点。
[0010]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0011]一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，包括以下步骤：
[0012](1)将细菌悬液滴加在电化学传感器的工作电极表面并孵育；
[0013](2)将Pt/Ni@GO纳米片滴加至(1)处理后的工作电极表面并孵育；
[0014](3)将电化学传感器的工作电极、参比电极和对电极连接到电化学工作站上，用磷
酸缓冲液作为反应基底液，进行i
‑
t曲线测定；
[0015]电化学传感器的工作电极固定有特异性抗体。
[0016]革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌不同，其外层具有较薄的肽聚糖网络结构且细胞膜较薄。而片层较薄的石墨烯材料其锋利的边缘能够穿透革兰氏阴性菌的致密膜与革兰氏阴性菌结合。
[0017]将待测细菌悬液滴加到工作电极表面并孵育后，工作电极上的特异性抗体捕获靶细菌，Pt/Ni@GO纳米片通过其锋利的片层边缘穿刺在革兰氏阴性菌细胞膜中，由于革兰氏阳性菌外层具有较厚的肽聚糖网络结构，纳米片较难穿刺进入，因此，Pt/Ni@GO纳米片只会与革兰氏阴性菌的细胞膜结合。
[0018]Pt、Ni具有催化过氧化氢的特性，在氧化石墨烯中掺杂Pt和Ni使得 Pt/Ni@GO纳米片具有过氧化物酶活性，可以产生电化学信号。Pt/Ni@GO 纳米片与工作电极结合后，能够显著改变电化学传感器的性能，i
‑
t曲线会发生显著变化。
[0019]本专利技术利用Pt/Ni@GO纳米片与细菌细胞膜的结合作用构建革兰氏阴性菌的电化学免疫传感器，能够有效的区分革兰氏阴性菌和阳性菌，无需使用二抗，利用Pt/Ni@GO纳米片的过氧化物酶活性能够替代酶的使用，实现与电极之间有效直接的电子传输，并且能够提高电化学检测的稳定性，用于革兰氏阴性菌的广谱检测。
[0020]优选地，将不同浓度的细菌滴加到特异性抗体修饰的电极上，然后在 37℃下温育1.5h，然后将Pt/Ni@GO纳米片滴在制备的电极表面，并在37℃下孵育1h。
[0021]进一步地，Pt/Ni@GO纳米片的制备方法为：
[0022](1)通过Hummers法制备并在水中超声得到GO分散液；
[0023](2)缓慢滴加氯化镍溶液，然后逐滴滴加硼氢化钠溶液，在搅拌下加热回流；
[0024](3)将氯铂酸缓慢滴加入混合液中反应获得Pt/Ni@GO纳米片。
[0025]氯铂酸溶液和氯化镍溶液以及GO分散液的浓度相同；
[0026]优选地，氯铂酸溶液与氯化镍溶液的体积比为1：0.8～1.0；
[0027]优选地，氯铂酸和氯化镍的溶液总体积与GO分散液的体积比为1： 10.0～11.0。
[0028]优选地，反应时间≥5h；
[0029]优选地，反应温度为90～100℃。
[0030]用于上述革兰氏阴性细菌的电化学检测方法的革兰氏阴性细菌的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极包括玻碳电极以及玻碳电极外封装的电化学活性材料，电化学活性材料包括Er
‑
CeO2粒子和金纳米粒子以及特异性抗体。
[0031]特异性抗体根据需要检测的细菌类型进行选择相应地特异性抗体，比如检测大肠杆菌则选择大肠杆菌的特异性抗体。在工作电极上负载金纳米粒子利于后续与抗体的结合，使得抗体有效的附着在工作电极表面；负载氧化铈能够提高电极的导电性，使用稀土元素铒制备铒掺杂的氧化铈，不仅能够提高导电性，还具有抗菌作用，下层材料能够在检测细菌的同时起到杀菌的作用。
[0032]一种革兰氏阴性细菌的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0033]S1：玻碳电极表面处理：将裸电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；
[0034]S2：负载Er
‑
CeO2与金纳米粒子：将Er
‑
CeO2粒子滴加在电极表面并孵育，然后电沉积上金纳米粒子；
[0035]S3：固定抗体：将特异性抗体滴加在负载下层材料的电极表面，并孵育；
[0036]S4：封闭电极：使用封闭试剂封闭非特异性吸附位点。
[0037]对玻碳电极进行抛光处理，使得Er
‑
CeO2粒子与金纳米粒子能够更好地负载，然后负载上Er
‑
CeO2粒子与金纳米粒子，特异性抗体与金纳米粒子结合，将抗体固定在电极表面，然后对电极进行封闭，制得特异性捕获革兰氏阴性菌体系。
[0038]具体的，采用氧化铝粉对玻碳电极进行抛光处理。
[0039]优选地，S2中的孵育时间≥30min；
[0040]优选地，S3中的孵育时间≥8h；
[0041]优选地，S3中的孵育温度为4℃。
[0042]进一步地，封闭试剂为牛血清白蛋白(BSA)。
[0043]优选地，冲洗电极三次后，滴加10μL 0.01g/mL B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将细菌悬液滴加在电化学传感器的工作电极表面并孵育；(2)将Pt/Ni@GO纳米片滴加至(1)处理后的工作电极表面并孵育；(3)将电化学传感器的工作电极、参比电极和对电极连接到电化学工作站上，用磷酸缓冲液作为反应基底液，进行i
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t曲线测定；所述电化学传感器的工作电极固定有特异性抗体。2.根据权利要求1所述的革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，其特征在于，所述Pt/Ni@GO纳米片的制备方法为：(1)通过Hummers法制备并在水中超声得到GO分散液；(2)缓慢滴加氯化镍溶液，然后逐滴滴加硼氢化钠溶液，在搅拌下加热回流；(3)将氯铂酸缓慢滴加入混合液中反应获得Pt/Ni@GO纳米片。3.根据权利要求2所述的革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，其特征在于，所述氯铂酸与氯化镍体积比为1：0.8～1.0；和/或，所述氯铂酸和氯化镍与所述GO体积比为1：10.0～11.0。4.用于权利要求1～3任一所述检测方法的革兰氏阴性细菌的电化学传感器，其特征在于，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极包括玻碳电极以及所述玻碳电极外封装的电化学活性材料，所述电化学活性材料包括Er
‑
CeO2粒子、金纳米粒子以及特异性抗体。5.权利要求4所述的革兰氏阴性细菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：玻碳电极表面处理：将裸电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；S2：负载Er
‑
CeO2与金纳米粒子：将Er
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CeO2粒子滴加在电极表面并孵育，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑颖，王少清，尧鹏，杨中柱，韩道宾，廖继成，刘斌，
申请(专利权)人：成都市第六人民医院郑颖，
类型：发明
国别省市：