一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及细胞膜蛋白质检测技术领域，特别是涉及一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用，该方法包括以下步骤：(1)分离人外周血单个核细胞；(2)提取外周血单个核细胞膜蛋白；(3)膜蛋白前处理；(4)纳升液相串联高分辨质谱检测，计算PBMC膜表面转运体表达量。本发明专利技术方法不仅可用于器官移植患者PBMC膜表面转运体的检测，也可以应用于其它免疫疾病患者PBMC膜表面转运体的检测；仅需约1

【技术实现步骤摘要】
一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及细胞膜蛋白质检测
，特别是涉及一种检测人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用。

技术介绍

[0002]器官移植术后需要使用免疫抑制剂预防器官排异反应的发生，用于器官移植的免疫抑制剂主要包括糖皮质激素、钙调酶抑制剂、抗增殖和抗代谢类抑制剂以及抗体类生物制剂。免疫抑制剂通过进入淋巴细胞，与淋巴细胞中的他克莫司结合蛋白(FKBP12)、mTOR等蛋白结合发挥药理作用，形成的TAC
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FKBP12、Sirolimus
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FKBP
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mTOR等复合物抑制参与T
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细胞激活的钙调磷酸酶，抑制T
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细胞激活从而发挥免疫抑制作用。淋巴细胞中免疫抑制剂的浓度才能够真正反映其发挥药效的浓度。
[0003]免疫抑制剂在体内代谢过程中通过转运体转运进出细胞，外排型转运体(ABCs)、摄取型转运体(SLCs)均会参与免疫抑制剂的转运过程。已有研究报道他克莫司是ABCB1、ABCA5的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Buffer 2和0.1mL TM
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PEK Reagent B；室温孵育45
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120min，垂直混悬仪轻柔混匀；4℃16000g离心15min。4.根据权利要求3所述的人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为，取80
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100μL细胞膜蛋白中加入1μL BSA溶液、20μL DTT和50μL NH4HCO3溶液，95℃孵育5min，放置10
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15min冷却至室温；加入20μL碘乙酰胺，室温避光孵育18
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22min；加入500μL冰甲醇、200μL氯仿、200μL水浓缩样本，涡旋3
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5min，4℃16000g离心5
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10min，室温放置10
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15分钟晾干；500μL冰甲醇清洗沉淀，涡旋3
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5min，4℃16000g离心5
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10min，室温放置30min晾干；40μL重悬溶液溶解沉淀；加入1μL胰酶于37℃下孵育24h；加入10μL 2.5％三氟乙酸
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25％乙腈水溶液终止反应，涡旋3min，4℃ 12000rpm离心5min，取上清溶液放入C18 Spin Columns进行脱盐，完成脱盐后用40μL0.1％甲酸
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50％乙腈水溶液洗脱，洗脱后加入20μL溶液内标工作液混匀。5.根据权利要求4所述的人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，纳升液相色谱条件为：流动相A由20mL超纯水中加入20μL甲酸，混匀后超声20分钟配制而成；流动相B由16mL乙腈中加入4mL超纯水和20μL甲酸，混匀后超声20分钟配制而成；捕获色谱柱为Acclaim Pepmap 100 C18色谱柱；分离色谱柱为Acclaim Pepmap RSLC C18色谱柱；柱温为20
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22℃；样品池温度为8℃；进样体积为5μL；按照如下梯度进行梯度洗脱：0
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5min，由97％流动相A和3％流动相B逐渐转变为92％流动相A和8％流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；5
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85min，由92％流动相A和8％流动相B逐渐转变为72％流动相A和28％流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；85
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102min，由72％流动相A和28％流动相B逐渐转变为62％流动相A和38％流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；102
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110min，由62％流动相A和38％流动相B逐渐转变为100％流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；110
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120min，为100％...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦伟，刘丽宏，李朋梅，王晓雪，陈文倩，张相林，
申请(专利权)人：中日友好医院中日友好临床医学研究所，
类型：发明
国别省市：