TDP-43蛋白病的建模制造技术

本文所述的发现是，TDP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】TDP
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43蛋白病的建模
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(3)要求2019年6月27日提交的美国临时申请序列号62/867,785的权益，所述临时申请的公开内容特此以引用的方式整体并入。
[0003]对经由EFS WEB以文本文件提交的序列表的引用
[0004]以文件10312WO01_ST25.txt编写的序列表是35千字节，在2020年6月25日创建，并且特此以引用的方式并入。


[0005]本文描述了评价TDP
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43及其结构域、非人动物和非人动物细胞以及核酸的生物学作用的方法。还提供了包含此类非人动物、非人动物细胞或核酸的TDP
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43蛋白病模型及其使用方法。

技术介绍

[0006]肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种破坏性的神经退行性疾病，其影响运动神经元，从而导致肢体瘫痪并最终因膈肌衰竭而死亡。在ALS患者组织的尸检中，一个几乎普遍的病理发现是TDP
‑<br/>43(反式激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非人动物细胞，其包含编码突变体TDP
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43多肽的突变TARDBP基因，其中所述突变体TDP
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43多肽缺乏在野生型TDP
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43多肽中发现的功能性结构域，其包括核定位信号(NLS)、RNA识别基序1(RRM1)、RNA识别基序2(RRM2)、推定的核输出信号(E)、朊病毒样结构域(PLD)或它们的组合，并且其中所述非人动物细胞表达所述突变体TDP
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43多肽，任选地其中所述野生型TDP
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43多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所陈述的序列。2.如权利要求1所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是胚胎干(ES)细胞、胚状体或胚胎干细胞衍生的运动神经元(ESMN)。3.如权利要求1或权利要求2所述的非人动物细胞，其中所述突变TARDBP基因是所述非人动物的突变TARDBP基因。4.如权利要求1
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2中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变TARDBP基因是突变人TARDBP基因。5.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽由于以下一项或多项而缺乏功能性结构域：(a)NLS中氨基酸的点突变，(b)RRM1中氨基酸的点突变，(c)RRM2中氨基酸的点突变，(d)核输出信号的至少一部分的缺失，以及(e)朊病毒样结构域的至少一部分的缺失。6.如权利要求5所述的非人动物细胞，其中(a)NLS中氨基酸的所述点突变包括K82A、K83A、R84A、K95A、K97A、K98A或它们的组合，(b)RRM1中的所述点突变包括F147L和/或F149L，(c)RRM2中的所述点突变包括F194L和/或F229L，(d)核输出信号缺失的至少一部分的所述缺失包括在野生型TDP
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43多肽的位置239和250处及其之间的氨基酸的缺失，以及(e)朊病毒样结构域的至少一部分的所述缺失包括在野生型TDP
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43多肽的位置274和414处及其之间的氨基酸的缺失。7.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽包含K82A、K83A、R84A、K95A、K97A和K98A。8.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽缺乏野生型多肽的位置274至414处的氨基酸之间并包括所述位置处的氨基酸的朊病毒样结构域。9.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽包含F147L和F149L。10.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽包含F194L和F229L。11.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述突变体TDP
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43多肽缺乏位置239和250处的氨基酸之间并包括所述位置处的氨基酸的核输出信号。12.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中编码突变体TDP
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43多肽的所
述突变TARDBP基因替换内源性TARDBP基因座处的内源性TARDBP基因。13.如权利要求13所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞对于编码突变体TDP
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43多肽的所述突变TARDBP基因是杂合的。14.如权利要求13所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞对于编码突变体TDP
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43多肽的所述突变TARDBP基因是纯合的。15.如权利要求1
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13中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞还包含含有敲除突变的TARDBP基因。16.如权利要求16所述的非人动物细胞，其中所述敲除突变包括条件性敲除突变。17.如权利要求15或权利要求16所述的非人动物细胞，其中所述敲除突变包含位点特异性重组识别序列。18.如权利要求15
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17中任一项所述的非人动物细胞，其中所述敲除突变包含loxp序列。19.如权利要求18所述的非人动物细胞，其中所述loxp序列侧接包含敲除突变的所述TARDBP基因的外显子3。20.如权利要求16所述的非人动物细胞，其中所述敲除突变包括TDP
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43肽的整个编码序列的缺失。21.如权利要求15
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20中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞对于所述修饰的TARDBP基因座是杂合的并且包含(i)在一条染色体的内源性TARDBP基因座处，内源性TARDBP基因被编码突变体TDP
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43多肽的所述突变TARDBP基因替换，以及(ii)在另一条同源染色体的所述内源性TARDBP基因座处，包含所述敲除突变的TARDBP基因或野生型TARDBP基因。22.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞不表达野生型TDP
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43多肽。23.如权利要求1
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21中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞表达野生型TDP
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43多肽。24.如前述前述权利中任一项所述的非人动物细胞，其包含：(i)与对照细胞中野生型TARDBP基因的mRNA转录水平相当的所述突变TARDBP基因的mRNA转录水平，(ii)与对照细胞中野生型TDP
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43多肽的水平相比，增加的所述突变体TDP
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43多肽的水平，(iii)在例如运动神经元的细胞质中发现的比在细胞核中更高浓度的突变体TDP
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43多肽，(iv)与野生型TDP
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43多肽相比具有增加的不溶性的突变体TDP
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43多肽，(v)包含所述突变体TDP
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43多肽的细胞质聚集体，(vi)增加的隐藏外显子的剪接，和/或(vii)降低的可变剪接的TDP
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43形式的水平。25.一种非人动物细胞，其包含(i)在一条染色体的内源性TARDBP基因座处，所述TARDBP基因的条件性敲除突变，和
(ii)在另一条同源染色体的所述内源性TARDBP基因座处，所述整个TARDBP编码序列的缺失。26.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞、原始外胚层细胞或衍生自运动神经元的运动神经元(ESMN)。27.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是啮齿动物细胞。28.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是大鼠细胞。29.如权利要求1
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27中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是小鼠细胞。30.如前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞在体外培养。31.一种非人动物组织，其包含前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞。32.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的非人动物细胞或组织。33.一种制备表达突变体TDP
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43多肽的非人动物或非人动物细胞的方法，其包括修饰所述非人动物或非人动物细胞的基因组以包含编码所述突变体TDP
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43多肽的突变TARDBP基因，其中所述突变体TDP
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43多肽与野生型TDP
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43相比缺乏功能性结构域，任选地其中所述野生型TDP
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43多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所陈述的序列。34.如权利要求33所述的方法，其中修饰包括用编码所述突变体TDP
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43多肽的所述突变TARDBP基因替换内源性TARDBP基因。35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其中修饰还包括用包含敲除突变的TARDBP基因替换内源性TARDBP基因。36.如权利要求35所述的方法，其中所述敲除突变包括条件性敲除突变。37.如权利要求36所述的方法，其还包括在消除包含敲除突变的所述TARDBP基因的表达的条件下培养所述细胞。38.一种鉴定用于治疗疾病的治疗候选物的方法，所述方法包括(a)使权利要求1
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31中任一项所述的非人动物细胞或组织或权利要求32所述的组合物与所述候选剂接触，(b)评价所述非人细胞或组织的表型和/或TDP
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43生物活性，以及(c)鉴定使非人细胞或组织恢复与表达野生型TDP
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43多肽的对照细胞或组织相当的表型和/或TDP
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43生物活性的所述候选剂。39.一种评价TDP
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43结构域的生物学功能的方法，其包括(a)修饰胚胎干(ES)细胞以包含编码突变体TDP
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43多肽的突变TARDBP基因，所述突变体TDP
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43多肽缺乏选自由以下组成的组的功能性结构域：核定位信号(NLS)、第一RNA识别基序(RRM1)、第一RNA识别基序(RRM2)、推定的核输出信号(E)、朊病毒样结构域(PLD)和它们的组合，(b)任选地在体外分化所述修饰的ES细胞和/或从所述修饰的ES细胞获得遗传修饰的非人动物，以及(c)评价所述遗传修饰的ES细胞、由其衍生的原始外胚层、由其衍生的运动神经元或由
其衍生的非人动物的表型和/或TDP
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43生物活性。40.如权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述表型通过细胞培养、荧光原位杂交、蛋白质印迹分析或它们的组合来评价。41.如权利要求38
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40中任一项所述的方法，其中评价表型包括测量所述遗传修饰的ES细胞、由其衍生的原始外胚层、由其衍生的运动神经元或由其衍生的非人动物的活力。42.如权利要求38
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41中任一项所述的方法，其中所述评价表型包括确定所述突变体TDP
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43多肽的细胞定位。43.如权利要求38
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42中任一项所述的方法，其中评价所述突变体TDP
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43多肽的生物活性包括测量受TDP
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43调控的包含隐藏外显子的基因的剪接产物。44.如权利要求43所述的方法，其中受TDP
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43调控的包含隐藏外显子的所述基因包括Crem、Fyxd2、Clf1。45.如权利要求38
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44中任一项所述的方法，其中评价所述突变体TDP
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43多肽的生物活性包括测量可变剪接的TDP
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43的水平。46.一种反义寡核苷酸，其包含靶向编码TDP
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43多肽的PLD和/或包含外显子6下游和外显子7上游的非翻译序列的TDP
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43mRNA序列的间隔体基序。47.一种siRNA，其包含靶向编码TDP
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43多肽的PLD和/或包含外显子6下游和外显子7上游的非翻译序列的TDP
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43mRNA序列的序列。48.一种CRISPR/Cas系统，其包含Cas9蛋白和至少一种gRNA，其中所述gRNA识别位于或靠近编码可变剪接位点的序列，所述序列产生编码截短的缺乏PLD的TDP
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43多肽的可变mRNA。49.一种非人动物，其包含权利要求2所述的胚胎干细胞。50.一种非人动物，其包含编码突变体TDP
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43多肽的突变TARDBP基因，其中所述突变体TDP
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【专利技术属性】
技术研发人员：阿尔蒂，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：