利用10-去乙酰巴卡亭III10β-O-乙酰转移酶突变体催化合成紫杉醇及其衍生物制造技术

本发明专利技术提供了10

【技术实现步骤摘要】
利用10
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去乙酰巴卡亭III 10
β
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O
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乙酰转移酶突变体催化合成紫杉醇及其衍生物
[0001]本申请是申请日为2016年5月24日、专利技术名称为“10
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去乙酰巴卡亭III 10β
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O
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乙酰转移酶突变体及其在催化合成紫杉醇及其类似物中的应用”的申请号为201610346558.4的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及10
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去乙酰巴卡亭III 10β
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O
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乙酰转移酶(DBAT)的一系列突变体蛋白，将来自但不限于乙酰辅酶A的酰基转移到10
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去乙酰紫杉烷上，生成紫杉醇或其类似物；突变体蛋白的酰基受体包括但不限于10
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去乙酰紫杉醇和10
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去乙酰巴卡亭III。本专利技术涉及这些突变体蛋白的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列及其应用。
技术背景
[0003]紫杉醇(paclitaxel,)是一个具有确切抗肿瘤疗效、主要来自于红豆杉但天然含量极低的“重磅炸弹”式药物，而10
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去乙酰巴卡亭III 10β
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O
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乙酰转移酶(DBAT)则是紫杉醇生物合成途径的一个重要酶，催化该途径的中间体10
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去乙酰巴卡亭III(10
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DAB)C10位上羟基的乙酰化反应，形成巴卡亭III，后者再经过若干步反应最终形成具有复杂结构的二萜类化合物——紫杉醇。
[0004]1996年，Zocher等首次报道以乙酰辅酶A为酰基供体、用来自欧洲红豆杉(Taxus baccata)的根部(蛋白)粗提液催化10
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DAB的C10位羟基乙酰化形成巴卡亭III，该粗提液显示区域选择性，即只对C10羟基具有乙酰化作用，而对于10
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DAB的C1、C7和C13位的游离羟基不起作用[Zocher,R,et al.Biosynthesis of Taxol:enzymatic acetylation of 10
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deacetylbaccatin
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III tobaccatin
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III in crude extracts from roots of Taxus baccata.Biochem Biophys Res Commun.,1996, 229(1):16
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20]。之后，Pennington等报道分别从东北红豆杉(Taxus cuspidata)的叶和悬浮培养细胞中得到了部分纯化的DBAT，均能在乙酰辅酶A存在的条件下催化10
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DAB形成巴卡亭III；但如果以10
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去乙酰紫杉醇(DT)为底物，则不能得到肯定的结果，表现在产物紫杉醇生成的不确定性、或因其产量不足而无显著性统计学意义，并认为最有可能的解释是：紫杉醇的时隐时现源于粗酶液中污染一种尚未被表征的乙酰辅酶A:10
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去乙酰紫杉醇
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O
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乙酰转移酶 [Pennington,JJ,et al.Acetyl CoA:10
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deacetylbaccatin
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III
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10
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O
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acetyltransferase activity in leavesand cell suspension cultures of Taxus cuspidata.Phytochemistry,1998,49(8):2261
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2266]。上述两篇文献仅涉及到DBAT粗酶液，其中夹杂着其他未被表征的蛋白质(或酶)，且其中的DBAT都未被表征；反应产物的鉴定也仅限于薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和同位素扫描，没有进行严格的波谱学证明，因此证据尚不够充分。1999年Menhard等报道从中国红豆杉(Taxuschinensis)的悬浮细胞中纯化到DBAT，该酶为单体蛋白，表观分子量为71
±
1.5kDa，最适pH 和最适温度分别为9.0和35℃，pI为5.6[Menhard B,Zenk MH.Purification and characterization ofacetyl coenzyme A:10
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hydroxytaxane O
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acetyltransferase from cell suspension cultures of Taxuschinensis.Phytochemistry,1999,50:763
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774]。该细胞系在优化条件下可产生高达150mg/L云南紫杉烷C(taxuyunnanine C，该化合物不含四元氧环)，以该化合物为原料水解制备出一系列去乙酰化的化合物(10
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deacetyltaxuyunnanine C,10,14
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deacetyltaxuyunnanine C, 5,10,14
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deacetyltaxuyunnanine C,2,10,14
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deacetyltaxuyunnanine C, 2,5,10,14
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deacetyltaxuyunnanine C)。催化实验证明该酶均能将这些化合物的C10位羟基乙酰化，但不能在其他位置上乙酰化，说明该酶具有区域选择性。还发现该酶也能将10
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DAB的C10位羟基乙酰化，但对10表
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10
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DAB(10
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epi
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10
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DAB)则不起作用，表现为立体选择性[Menhard B, Zenk MH.Purification and characterization of acetyl coenzyme A:10
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hydroxytaxaneO
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acetyltransferase from cell suspension cultures of Taxus chinensis.Phytochemistry,1999, 50:763
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774]。
[0005]2000年Croteau实验室首次报道从东北红豆杉(Taxus cuspidata)中克隆到DBAT cDNA [Walker K,Croteau R.Molecular cloning of a 10
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deacetylbaccatin III
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10
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O
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acetyltransferase cDNAfrom Taxus a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种10
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去乙酰巴卡亭III 10β
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O
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乙酰转移酶DBAT的突变体蛋白，其特征在于，与氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的野生型蛋白DBAT相比，所述的突变体蛋白在301位氨基酸处具有选自下组中的一种突变：F301V、F301C、F301A、F301M、F301L、F301T、F301S。2.根据权利要求1的突变体蛋白，其特征在于，所述的突变体蛋白具有F301V氨基酸突变。3.根据权利要求1或2的突变体蛋白，其特征在于，所述的突变体蛋白与野生型蛋白DBAT相比，其氨基酸突变还包括：G38W、G38Y、G38I、G38T、G38E、G38M、G38Q、G38C、G38S、G38D、G38H、G38A、C216R，以及以上氨基酸突变的组合。4.根据权利要求1
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3任一项的突变体蛋白，其特征在于，所述的突变体蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO 3～SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。5.一种编码权利要求1
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4任一项所述突变体蛋白的核苷酸序列。6.根据权利要求6的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列选自SEQ ID NO 26～SEQ ID NO 37所示的核苷酸序列。7.一种含有权利要求5
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6任一项所述的核苷酸序列的重组质粒。8.一种含有权利要求5
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6任一项所述的核苷酸序列或权利要求7所述的重组质粒的重组细胞。9.权利要求1
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4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱平，李炳娟，王豪，陈天娇，陈晶晶，巩婷，杨金玲，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：