电位滴定DNA微阵列、其制造方法及核酸解析方法技术

本发明专利技术涉及低使用费、低价格、而且能够高精度测定的ＤＮＡ微阵列、其制造方法及核酸解析方法。使核酸探针（３）在电场效应晶体管的栅绝缘物表面固定化，在栅绝缘物表面和目标基因进行杂交，利用电场效应检测此时产生的表面电荷密度的变化。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于基因诊断、DNA序列解析或者基因多型解析等生物
，特别是基因检查领域的技术，更详细地说，是关于能够高精度、并列地解析数个不同的核酸的电位滴定DNA微阵列，其制造方法及核酸解析方法。
技术介绍
以人类基因组计划为代表的各种生物的基因组碱基序列解析计划正迅速进展，蓄积着庞大的碱基序列信息。已正在决定人类基因组的全碱基序列。今后通过弄清生物中的基因的机能，推测在各种疾病的诊断、医药品的开发、农作物的品种改良等广泛领域与基因相关技术的开发会飞跃地发展。除了碱基序列信息以外还有基因的发现和机能信息成为这些新领域发展的基础。作为大规模地进行基因的机能及发现解析、向基因检查发展的技术，Affymetrix公司、Nanogen公司等正在开发DNA芯片或者DNA微阵列(以下，将两者统称为DNA微阵列)。但是，现状的DNA微阵列大多以荧光检测为基本原理，因此需要激光器或复杂的光学系统，从而使系统大型化，高价。另外，现在正在开发的所有DNA微阵列，原则上只使用一次就废弃。即使能够洗净重复使用，限度最多使用2次至3次。因此，在使用许多试样的解析或检样的数目多的基因诊断等领域，使用费成为大问题。特别，在医疗领域，从控制医疗费的观点来看，高额的检查广泛普及是困难的。另一方面，在医疗领域，即基因诊断的领域，要求高精度、定量性。因此要求满足成本低和高精度化两者的技术。作为解决这些问题的方法，报道了一些与氧化·还原标识组合的电流检测方式的DNA微列。Clinical Micro Sensors公司正在开发，在金属电极上使称做分子丝的分子的一端固定化，在另一端结合核酸探针，以基于和目标基因的杂交的氧化·还原标识和金属电极的电子授受为作为电流变化进行检测，来检测目标基因的方式(NatureBiotechnology，vol.16，(1998)p27，p.40)。该方式不需要高价的激光器或复杂的光学系统，因此能够构筑简单、小型的系统。但是，由于以金属电极上的氧化·还原反应作为检测的基本原理，因此，如果在试样中存在氧化物质或者还原物质(例如抗坏血酸)，基于氧化或者还原流出电流，构成基因检测的妨碍，使检测精度劣化。另外，伴随电流计测，在金属电极上进行电极反应。由于电极反应是不可逆、非平衡反应，因此发生电极的腐蚀、气体的生成等，而损害电流测定的稳定性，特别在反复测定的场合，检测精度劣化。因此本专利技术的目的在于提供低使用费、低价格系统、而且可以高精度测定的DNA微阵列及其制造方法，以及使用该DNA微阵列的核酸解析方法。
技术实现思路
本专利技术是使核酸探针在绝缘物表面固定化、在绝缘物表面和目标基因进行杂交，检测此时产生的电荷密度变化的DNA微阵列。优先选择的是使核酸探针在电场效应晶体管的栅绝缘物表面固定化、在栅绝缘物表面和目标基因进行杂交，利用电场效应来检测此时产生的电荷密度变化的方式的DNA微阵列。为了使表面电荷密度的变化大，除了核酸自身保持的电荷以外，还进行嵌入剂的导入或在核酸中标识和离子等电荷粒子形成复合体的分子等，实现了以大的信号/杂音比能够检测表面电位变化的电位滴定DNA微阵列。使用本专利技术的DNA微阵列的基因解析方法，不需要高价的激光器或复杂的光学检测系统，并且与电流检测(电流滴定)方式不同，是使核酸探针在绝缘物基板上固定化，检测平衡状态下的表面电位，因此由基板的腐蚀或气体的产生、氧化/还原物质的妨碍等引起的信号值的不稳定性不会成为问题，稳定性优良的高精度的基因检测成为可能。即，本专利技术的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管和参照电极。另外，本专利技术的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备形成有数个绝缘栅电场效应晶体管的基板，在基板的表面，使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在各绝缘栅电场效应晶体管的沟道部的栅绝缘物上固定化。再者，本专利技术的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使具有和应该检测的核酸的一部分互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第1绝缘栅电场效应晶体管、使和应该检测的核酸哪个部分都不互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第2绝缘栅电场效应晶体管、以及将第1绝缘栅电场效应晶体管和第2绝缘栅电场效应晶体管的输出进行比较检测的电路。本专利技术的核酸解析方法，其特征在于，具有(a)在具有使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有至少一种核酸的试样溶液，与单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤，(b)在基板上导入洗涤液，从上述基板除去未反应的核酸的步骤，(c)在基板上导入嵌入剂溶液，与成为双链的核酸发生反应的步骤，(d)在基板上导入洗涤液，从基板上除去未反应的嵌入剂的步骤，(e)在基板上导入缓冲液，测定绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。除上述步骤(a)至步骤(e)以外，还具有(f)加热基板使单链核酸探针或者分支核酸探针和已杂交的核酸离解的步骤，(g)在基板上导入洗涤液，从单链核酸探针或者分支核酸探针除去离解的核酸和嵌入剂的步骤，随后，如果反复上述步骤(a)至步骤(e)，就能够连续进行数个测定。本专利技术的核酸解析方法，其特征在于，还具备(a)在具有使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有以能获取电荷粒子的分子标识的核酸片段的试样溶液，与单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤，(b)在基板上导入洗涤液，从上述基板除去未反应的核酸片段的步骤，(c)在基板上导入含有和标识分子形成复合体的离子的溶液，与成为双链的核酸中被标识的分子发生反应，形成离子和标识分子的复合体的步骤，(d)测定绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。能获取电荷粒子的分子，可以是和1价或者2价的阳离子或者阴离子选择性地形成复合体的分子，例如，缬氨霉素、无活菌素/单活菌素、双冠醚、杯芳烃衍生物、非环状聚醚衍生物、季铵盐、紫菜碱、或者这些分子的衍生物。此时，在各个不同种类的核酸片段上标识能获取电荷粒子的数种分子，通过在基板上导入对应于各分子的电荷粒子(离子)，能够同时或者依次地测定数种基因或者基因多型。除上述步骤(a)至步骤(d)以外，还具有(e)加热基板使单链核酸探针或者分支核酸探针和已杂交的核酸片段离解的步骤，(g)在基板上导入洗涤液，从单链核酸探针或者分支核酸探针除去已离解的核酸片段的步骤，随后，如果反复上述步骤(a)至步骤(d)，能够连续地进行数个测定。本专利技术的电位滴定DNA微阵列的制造方法，其特征在于，具有在绝缘物基板的第1表面形成硅膜的步骤，使该硅膜图案化、分离成数个硅膜形成区域的步骤，在各硅膜形成区域形成成为各个电场效应晶体管的源极·漏极区域、加热元件、温度传感器的数个pn结的步骤，以源极·漏极区域之间作为沟道、从源极·漏极区域形成信号配线的步骤，在绝缘物基板的和形成有硅膜的面相反侧的第2表面上，使核酸探针直接或者通过载体在对应于电场效应晶体管的沟道部分固定化的步骤。本专利技术的电位滴定DNA微阵列的制造方法，其特征在于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电位滴定ＤＮＡ微阵列，其特征在于，具备使单链核酸探针或分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管以及参照电极。

【技术特征摘要】
1.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使单链核酸探针或分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管以及参照电极。2.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备形成有数个绝缘栅电场效应晶体管的基板，在上述基板的表面，使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在各绝缘栅电场效应晶体管的沟道部的栅绝缘物上固定化。3.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，其具备使具有和应该检测的核酸的一部分互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第1绝缘栅电场效应晶体管、使具有和应该检测的核酸的哪个部分都不互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第2绝缘栅电场效应晶体管、将上述第1绝缘栅电场效应晶体管和上述第2绝缘栅电场效应晶体管的输出进行比较检测的电路。4.一种核酸解析方法，其特征在于，具有(a)在具有各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有至少一种核酸的试样溶液，和上述单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤；(b)在上述基板上导入洗涤液，从上述基板上除去未反应的核酸的步骤；(c)在上述基板上导入嵌入剂溶液，和成为双链的核酸发生反应的步骤；(d)在上述基板上导入洗涤液，从基板上除去未反应的嵌入剂的步骤；(e)在上述基板上导入缓冲液，测定上述绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。5.根据权利要求4所述的核酸解析方法，其特征在于，还具有(f)加热上述基板，使和上述单链核酸探针或者分支核酸探针杂交过的核酸离解的步骤；(g)在上述基板上导入洗涤液，从上述单链核酸探针或者分支核酸探针除去已离解的核酸和嵌入剂的步骤；随后，反复上述步骤(a)～步骤(e)。6.一种核酸解析方法，其特征在于，其具备(a)在具有各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有以获取电荷粒子的分子标识的核酸片段的试样溶液，与上述单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫原裕二，保田健二，服部久美子，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：JP[日本]