一种综合评价人体免疫功能的检测方法技术

本发明专利技术涉及医疗领域，公开了一种通过联合外周血淋巴细胞亚群的流式检测以及外周血淋巴细胞活力检测的方法，用以综合评价人体免疫功能的情况。本项发明专利技术在检测方法上增加了调节性T细胞和髓样抑制细胞的流式检测，同时联合外周血淋巴细胞的活力检测方法；在评价方法上，综合免疫细胞亚群的评价结果、受检细胞和免疫细胞自我增殖活性、受检细胞和免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力的结果，更加学准确、全面的评估机体的免疫功能状态。的评估机体的免疫功能状态。

【技术实现步骤摘要】
一种综合评价人体免疫功能的检测方法


[0001]本专利技术涉及医疗领域，特别提供一种综合评价人体免疫功能的检测方法。这一检测方法更加科学准确、全面的评估机体的免疫功能状态，也使结果更具有参考价值。

技术介绍

[0002]免疫系统是机体执行免疫应答以及免疫功能的重要系统，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调.共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。近年来肿瘤发病率的不断增高，其中免疫系统的失衡和衰退占有主要因素。
[0003]本项专利技术公开一种综合评价人体免疫功能的检测方法，通过机体对肿瘤细胞的识别杀伤作用，并联合流式检测结果对免疫功能进行综合评价，能够更加科学全面的评估机体状态和肿瘤的发病风险。

技术实现思路

[0004]为提高人体免疫功能检测方法的准确性和全面性，本专利技术提供了一种综合评价人体免疫功能的检测方法，主要包括以下检测步骤：一、抗凝外周血的流式检测提取10-30 uL受检者抗凝外周血，应该用BD公司的流式细胞检测仪（仪器编号：FACSVia）以及BD公司生产的淋巴细胞亚群检测试剂盒（NO:340503)来检测淋巴细胞亚群:总T细胞亚群、CD8细胞亚群、CD4细胞亚群、B细胞亚群、NK细胞亚群、调节性T细胞亚群、髓样抑制细胞亚群；并计算CD4/CD8的比值。
[0005]二、提取抗凝外周血的PBMC1.提取10-30 mL受检者抗凝外周血，以1：1的比例加入密度梯度离心液10-30 mL。
[0006]2.密度梯度离心：将加好密度梯度离心液的样本进行密度梯度离心：2051 rpm,离心25 min；梯度离心结束后提取中间白膜层，白膜层即为受检者的PBMC。
[0007]3.洗涤:向受检者PBMC内加入15-25 mL PBS进行洗涤，应用离心机1000 rpm，5 min；离心结束后将液体弃去，只留下底层细胞。
[0008]4.二次洗涤：向步骤3中的细胞内加入15-25 mL PBS，应用离心机1000 rpm5 min进行二次洗涤。
[0009]5.向步骤4中得到的细胞加入1-3mL CIK培养基，留以使用。
[0010]三、铺板1.肿瘤细胞116：116细胞为本实验室储存，用含有10%的新生牛血清RPM1640培养基进行培养。在活力检测前4-6小时将肿瘤116细胞接种到96孔板，其中每孔加入培养液体积为50-100 uL，细胞接种数量为2
×
10
3-4
×
103个。共需要接种9孔，其中3孔为和受检细胞共培养，3孔为和激活的免疫细胞共培养，3孔为阴性对照。
[0011]2.激活的免疫细胞：激活的免疫细胞CIK为本实验室储存，在接种时与受检细胞同时提前4-6小时内接种到96孔板，其中每孔加入培养液体积为50-100 uL，细胞接种数量为8
×
10
4-105个。共需要接种6孔，其中3孔为独立孔，3孔为和肿瘤细胞116共培养。
[0012]3.受检者的PBMC细胞：使用步骤2-5中得到的受检者的PBMC细胞进行铺板，用含有10%新生牛血清CIK培养基进行培养，其中每孔加入培养液体积为50-100 uL，细胞接种数量为8
×
10
4-105个。共需要接种6孔，其中3孔为独立孔，3孔为和肿瘤细胞116共培养。
[0013]四、培养及拍照铺板后立即在倒置显微镜下采集细胞图像，采集结束后放入孵箱内进行培养，在48 h后再次采集细胞的增殖状况以及免疫细胞和受检细胞分别对肿瘤细胞的识别杀伤图像，每孔内不同视野采集图像数量不少于10张。
[0014]五、免疫功能评价的说明1.与正常范围内的参考区间进行比较，对应用流式检测的淋巴细胞亚群进行评价1）总T细胞亚群：T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。总T细胞比例上升，表明机体的适应性免疫应答存在过度活跃状态，提示机体可能存在感染性疾病、自身免疫性疾病等状态；总T细胞比列下降，表明机体整体的适应性免疫应答能力下降，可能会引发恶性肿瘤、结核病等。
[0015]2）CD8细胞亚群：CD8细胞是T淋巴细胞其中的一个亚群。在正常的T淋巴细胞亚群检测中，CD8淋巴细胞应该占到15%-44%左右。CD8细胞代表细胞毒性T细胞，其可以抵制外来病原体的入侵，具有杀伤靶细胞的重要作用，因此对机体是有一定保护作用的。CD8比例上升表明机体可能存在炎症反应，如乙肝、丙肝等慢性肝炎、病毒感染等；CD8比例下降表明机体对靶细胞杀伤能力下降，一般可以见于风湿免疫系统，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。
[0016]3）CD4细胞亚群：CD8细胞是T淋巴细胞其中的一个亚群。在正常的T淋巴细胞亚群检测中，CD4淋巴细胞应该占到21%-51%左右。CD4细胞代表着辅助性T细胞，其可以对细胞免疫、体液免疫起到辅助的作用。CD4比例上升表明机体免疫抑制占优势，表明机体可能存在免疫衰退、脏器炎性微环境异常以及长期亚健康状态；CD4比例下降表明调控机体免疫功能下降，常见于艾滋病、重大手术预后、恶性肿瘤等。
[0017]4）CD4/CD8的比值：CD4/CD8的比值时监测机体内免疫功能能状态的重要指标，比值升高表明机体处于“过度免疫活跃”的状态，常见于I型糖尿病、类风湿性关节炎的活动期等；比值降低说明机体处于“免疫抑制”状态，常见艾滋病、骨髓移植的恢复期、恶性肿瘤复发期等。5）B细胞亚群：B细胞在抗原刺激下可分化成浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体免疫球蛋白，主要执行机体的体液免疫。B细胞数值上升说明机体内近期可发生细菌或病毒感染；B细胞数值下降说明机内体液免疫功能下降，常见于淋巴瘤等。
[0018]6）NK细胞亚群：NK细胞是自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒和免疫调节有关，而且还在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞亚群数量下降，表明机体自然杀伤能力下降，进一步提升机体固有免疫功能下降。
[0019]7）调节性T细胞亚群：调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。调节性T细胞亚群的失常常见于重症肌无力、多发性硬化、自身溶血性贫血等。
[0020]8）髓样抑制细胞：是一群具有免疫抑制功能细胞的统称，由未成熟的巨噬细胞、粒细胞、树突细胞和其他处于早期分化的骨髓细胞组成，他对机体的平衡状态具有维持作用，并且能够对肿瘤的产生起到免疫监视作用。
[0021]2．外周血淋巴细胞活力检测结果：1）受检细胞、免疫细胞自我增殖的活性检测结果评价：根据采集到的图片分为六个等级：良好：细胞呈现圆形，每孔内细胞数量大于5
×
105个。
[0022]轻度：细胞呈现圆形，每孔内细胞数量4
×
10
5 -ꢀ5×
105个。
[0023本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种综合评价人体免疫功能的检测方法，其特征在于包括以下检测步骤：1）抗凝外周血流式检测：提取受检者抗凝外周血10-30 μL,加入相应抗体，对总T细胞、CD4细胞亚群、CD8细胞亚群、NK细胞亚群、调节性T细胞、髓样抑制细胞进行流式检测；2）提取PBMC:取受检者抗凝外周血10-20 mL，以1:1的比例加入密度梯度分离液10-20 mL；3）铺板：肿瘤细胞每孔铺板数量为：2
×
10
3 -ꢀ4×
103个，免疫细胞每孔铺板数量为：8
×
10
4 -ꢀ
105个，肿瘤细胞除...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏丽杰，高梦聪，
申请(专利权)人：沈阳康为医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：