一种NKT细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清培养基重悬；（2）将步骤（1）重悬后的细胞接种在CD3抗体和缬草油包被的培养容器中，培养12小时后加入IL

【技术实现步骤摘要】
一种NKT细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种NKT细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]NKT细胞(Natural killer T cell)是一种细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT细胞能大量产生细胞因子，且可以发挥与NK细胞相似的细胞毒作用。。NKT细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中。
[0003]NKT细胞作为一类新的免疫调节细胞在抗肿瘤免疫，克服移植排斥，以及抑制自身免疫性疾病的发生中发挥着至关重要的作用。NKT细胞的功能异常与多种临床疾病，如恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。研究还显示，调控NKT细胞的功能可达到对肿瘤以及多种人类疾病的治疗效果。
[0004]为了满足NKT细胞在临床的应用需求，体外培养NKT细胞成为获得足够数量具有活性的NKT细胞有效途径。常见的NKT细胞体外培养方法是在添加诸多细胞因子的培养基中培养外周血单个核细胞，在细胞因子的刺激下诱导外周血单个核细胞成为NKT细胞。在常见的培养过程中，需要添加各类因子，但是常规培养方法得到的NKT细胞增殖率较低，获得的细胞数量有限，并且细胞活性差，限制了NKT细胞在临床的应用。因此，有必要提供一种NKT细胞的培养方法，提高NKT细胞的体外增殖效率。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种NKT细胞的培养方法，具有增殖效率高，细胞活性好的特点。
[0006]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清培养基重悬；（2）将步骤（1）重悬后的细胞接种在CD3抗体和缬草油包被的培养容器中，培养12小时后加入IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，继续培养过程中及时补充添加IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸的无血清培养基；（3）培养3
‑
4天后补充的无血清培养基中添加以下成分：羟基芫花素、2
‑
巯基乙醇、维生素B3、IL
‑
2、IL
‑
21，每隔2
‑
3天补液一次，培养至第14天收获NKT细胞。
[0007]优先地，步骤（2）中添加的IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：IL
‑
2 1000
‑
1500U/mL、IFN
‑
γ500
‑
1000 U/mL、异丙肌苷10
‑
15μg/mL、钛酸钙3
‑
8μg/mL、抗坏血酸6
‑
10μg/mL。
[0008]优先地，步骤（2）中添加的IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：IL
‑
2 1300U/mL、IFN
‑
γ800U/mL、异丙肌苷12μg/mL、钛酸钙6μg/mL、抗坏血酸8μg/mL。
[0009]优先地，步骤（3）中添加的羟基芫花素、2
‑
巯基乙醇、维生素B3、IL
‑
2、IL
‑
21在培养
基中的终浓度为：羟基芫花素20
‑
30ng/mL、2
‑
巯基乙醇10
‑
20 ng/mL、维生素B3 1
‑
5μg/mL、IL
‑
21000
‑
1500U/mL、IL
‑
21 800
‑
1200 U/mL。
[0010]优先地，步骤（3）中添加的羟基芫花素、2
‑
巯基乙醇、维生素B3、IL
‑
2、IL
‑
21在培养基中的终浓度为：羟基芫花素25ng/mL、2
‑
巯基乙醇15ng/mL、维生素B3 3μg/mL、IL
‑
2 1200U/mL、IL
‑
21 1000U/mL。
[0011]优先地，无血清培养基为AIM
‑
V培养基。
[0012]优先地，步骤（2）中培养容器的包被过程如下：向PBS中加入CD3抗体和缬草油，CD3抗体和缬草油在PBS中的浓度为：CD3抗体4
‑
8μg/mL、缬草油1
‑
5ng/mL，在4℃下包被过夜。
[0013]优先地，步骤（1）中细胞密度为1
‑3×
106个/mL。
[0014]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种NKT细胞的培养方法，将外周血单个核细胞接种在CD3抗体和缬草油包被的容器中，有助于细胞保持稳定的状态，然后在培养基中添加IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，有助于激活更多的NKT细胞。培养3
‑
4天后在培养基中添加羟基芫花素、2
‑
巯基乙醇、维生素B3、IL
‑
2、IL
‑
21继续扩增培养NKT细胞，采用上述培养过程得到的NKT细胞数量多，增殖效率有显著提高，而且得到的NKT细胞活性高，临床应用效果更好。
具体实施方式
[0015]下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
[0016]实施例1一种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清AIM
‑
V培养基重悬，细胞密度为1
×
106个/mL；（2）取T75培养瓶采用包被液在4℃下包被过夜，包被液的制备过程如下：向PBS中加入CD3抗体和缬草油，CD3抗体和缬草油在PBS中的浓度为：CD3抗体6μg/mL、缬草油3ng/mL，取步骤（1）重悬后的细胞15mL接种在包被后T75培养瓶中，培养12小时后加入IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，继续培养过程中及时补充添加IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸的AIM
‑
V培养基，使细胞密度保持在1
×
106个/mL；IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：IL
‑
2 1300U/mL、IFN
‑
γ800U/mL、异丙肌苷12μg/mL、钛酸钙6μg/mL、抗坏血酸8μg/mL。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NKT细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）自外周血中分离出外周血单个核细胞，采用无血清培养基重悬；（2）将步骤（1）重悬后的细胞接种在CD3抗体和缬草油包被的培养容器中，培养12小时后加入IL
‑
2、IFN
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γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸，继续培养过程中及时补充添加IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸的无血清培养基；（3）培养3
‑
4天后补充的无血清培养基中添加以下成分：羟基芫花素、2
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巯基乙醇、维生素B3、IL
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2、IL
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21，每隔2
‑
3天补液一次，培养至第14天收获NKT细胞。2. 根据权利要求1所述NKT细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中添加的IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：IL
‑
2 1000
‑
1500U/mL、IFN
‑
γ500
‑
1000 U/mL、异丙肌苷10
‑
15μg/mL、钛酸钙3
‑
8μg/mL、抗坏血酸6
‑
10μg/mL。3.根据权利要求1所述NKT细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）中添加的IL
‑
2、IFN
‑
γ、异丙肌苷、钛酸钙、抗坏血酸在培养基中的终浓度为：IL
‑
2 1300U/mL、IFN
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γ800U/mL、异丙肌苷12μg/mL、钛酸钙6μg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国强，石连勇，
申请(专利权)人：李国强，
类型：发明
国别省市：