一种奶牛早期妊娠的检测方法技术

本申请属于生物诊断学技术领域，具体公开了一种奶牛早期妊娠的检测方法，其包括如下步骤：将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃

【技术实现步骤摘要】
一种奶牛早期妊娠的检测方法


[0001]本申请属于生物诊断学
，更具体地说，它涉及一种奶牛早期妊娠的检测方法。

技术介绍

[0002]反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会释放包括PAG在内的物质到母畜血液中。利用蛋白质的抗体能够检测母体外周循环中PAG蛋白质的存在，这些蛋白质对胎盘组织来说具有特异性，所以检测母体血液里面的PAGs能够作为妊娠的指标。通过免疫学方法检测PAGs与B超结果符合率非常高，并且能够在配种后30天即可获得是否怀孕的结果。但是目前检测PAGs大多采用ELISA检测方法，需要特殊检测设备，这对于养牛场来说，成本较高，而且也要求操作人员的技术水平较高。

技术实现思路

[0003]为了脱离特殊检测设备的限制，本申请提供一种奶牛早期妊娠的肉眼可视化检测方法，该方法无需特殊检测设备，操作简单，肉眼即可判断而且所需检测时间较短，适合于大型养牛场快速诊断奶牛的妊娠状况。
[0004]本申请是通过以下方案实现的：本申请提供一种快速判断奶牛早期妊娠的检测方法，其包括如下步骤：将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃
‑
37℃恒温固定30 min
‑
8 h；向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；将待测样品加入到点样孔中进行第一孵育，4℃
‑
37℃孵育30 min
‑
8 h；向点样孔中加入二抗孵育后，清洗，加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。
[0005]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体水溶液。
[0006]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2。
[0007]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2，且含有1% BSA。
[0008]本申请的专利技术人通过实验不同的PAG6抗体溶液对检测结果的影响，从而选出显色效果最好的PAG6抗体溶液。
[0009]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为2
‑
50μg/mL。例如，所述PAG6抗体溶液的浓度为2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL等。
[0010]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为8
‑
15μg/mL。
[0011]在本申请的一个具体实施方式中，所述PAG6抗体溶液的浓度为10μg/mL。
[0012]在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定温度为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃。
[0013]在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定时间为30 min、40 min、50 min、1 h、1.2 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5 h或8 h。
[0014]在本申请的一个具体实施方式中，恒温固定条件为37℃固定30
‑
60min。
[0015]本申请的专利技术人通过实验恒温固定的温度和时间，从而摸索出时间最短，显色最佳的条件，以提高检测效率。
[0016]在本申请的一个具体实施方式中，所述封闭液为5%BSA或5%脱脂乳。本申请的专利技术人通过实验不同的封闭液，从而摸索出显色效果较佳，成本最低的封闭液，以降低成本。
[0017]在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的温度为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃。
[0018]在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的时间为30 min、40 min、50 min、1 h、1.2 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7 h、7.5 h或8 h。
[0019]在本申请的一个具体实施方式中，所述第一孵育的温度为37℃，孵育时间为60 min。
[0020]本申请的专利技术人通过实验孵育时的温度和时间，从而摸索出时间最短，显色最佳的条件，以提高检测效率。
[0021]在本申请的一个具体实施方式中，所述二抗为山羊抗鼠IgG。
[0022]在本申请的一个具体实施方式中，所述显色液为DAB、TMB或ECL。本申请的专利技术人通过实验不同的显色液的显色效果，从而筛选出显色效果最佳的显色液。通过筛选，最终选择DAB作为显色液。
[0023]在本申请的一个具体实施方式中，所述显色的时间为1
‑
10 min。例如显色时间为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min或10 min。
[0024]在本申请的一个具体实施方式中，所述显色的时间为3 min。
[0025]本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法至少具有以下有益效果之一：本申请提供的奶牛早期妊娠的检测方法，其操作简单，无需昂贵的设备，肉眼即可进行判断，降低了成本，克服了牛场基层兽医文化水平低的问题而且检测效率高。
附图说明
[0026]图1为本申请实施例中固定载体的选择的实验结果图。
[0027]图2为本申请实施例中PAG抗体溶液选择的实验结果图。
[0028]图3为本申请实施例中PAG抗体浓度选择的实验结果图。
[0029]图4为本申请实施例中固定条件选择的实验结果图。
[0030]图5为本申请实施例中封闭剂种类选择的实验结果图。
[0031]图6为本申请实施例中待检血清孵育条件选择的实验结果图。
[0032]图7为本申请实施例中显色液选择的实验结果图。
[0033]图8为本申请实施例中显色时间选择的实验结果图。
[0034]图9为本申请实施例中PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）特异性结合的实验结果图。其中，M为marker；1为PAG6抗体与PAG6融合蛋白（抗原）的特异性结合后的产物。
具体实施方式
[0035]除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0036]下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037]本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种奶牛早期妊娠的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将PAG6抗体溶液点样至NC膜的点样孔中，于4℃
‑
37℃恒温固定30 min
‑
8 h；向点样孔中加入封闭液进行封闭，封闭后进行清洗；将待测样品加入到点样孔中进行第一孵育，4℃
‑
37℃孵育30 min
‑
8 h；向点样孔中加入二抗孵育后，清洗，加入显色液进行显色，滴加双蒸水终止反应，风干，观察结果。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体水溶液；或所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2；或所述PAG6抗体溶液为PAG6抗体的PBS缓冲液，pH为7.2，且含有1% BSA。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相国，乔富强，肖龙菲，倪和民，郭勇，李志明，杨宇泽，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：