本发明专利技术提供了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA(rDNA)寡核苷酸混合探针套，并公开了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA(rDNA)寡核苷酸混合探针套的开发方法。具体为：利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对,获得5S rDNA和45S rDNA(5.8S、18S和28S)共有序列；再利用该数据在Oligo7软件开发5S rDNA和45S rDNA探针；合成的5S rDNA和45SrDNA寡核苷酸探针套分别包含2条和10条寡核苷酸探针。本发明专利技术开发的寡核苷酸探针开发方法和探针套，可有效的用于菊属植物染色体分析核型图谱的构建，通过组配好的寡核苷酸探针套通过FISH分析进行检测，避免克隆重组、标记探针的繁琐程序和异源片段，大大简化了FISH分析的程序，提高了实验效率。提高了实验效率。提高了实验效率。
【技术实现步骤摘要】
一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套及开发方法
[0001]本专利技术属于分子细胞遗传学研究领域，公开了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套。
技术介绍
[0002]菊属植物主要分布自欧洲和亚洲，具有很高的观赏价值，被认为是春黄菊族中重要的观赏园艺作物。作为菊花的核心种质资源，菊属植物的细胞学研究目前还未被完全明晰，这对探索菊花起源问题和菊花遗传育种研究产生了巨大阻碍。
[0003]核糖体DNA(rDNA),是一种高度保守的串联重复序列，在属中植物的变异在自然选择的巨大压力下被保存下来。在高等真核生物中，rDNA被分为两类：占主要部分的45S rDNA序列编码28S、5.8S、18S rRNA,而较少的5SrDNA编码5S rRNA。在不同植物的基因组中，5SrDNA和45S rDNA的位点数量存在差异并且这些成百上千的单元在串联重复中出现，反映为染色体位点上单位点和多个位点。45S rDNA单元结构大多以微卫星序列的形式出现在核仁组织区(NORs),其位点不同于5S rDNA位点，位于次缢痕区域。因此，利用55rDNA和45S rDNA 作为探针对属内植物进行FISH检测。
[0004]常规的5S rDNA和45S rDNA探针通常需要通过BAC克隆，且获得的探针还需经过的缺刻平移法或随机引物法标记，过程繁琐，成本较高。除此以外，以常用的pTa71(45S rDNA)探针为例，该探针来源于小麦的45S rDNA，其中异源的片段可能会对荧光信号产生干扰。其次，小麦作为单子叶植物，与双子叶的菊属植物间的差异也可能对相应结果产生影响。因此，有必要基于菊属植物及其近缘属的参考基因组数据开发更特异便捷的5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针、在更精细的灵敏度上来明晰菊属不同物种间的差异。新兴的寡核苷酸荧光原位杂交(Oligo-FISH)技术被广泛应用，基于重复序列开发的寡核苷酸探针进行FISH分析，逐渐成为植物基因组分析的重要方法，并且已经在小麦(Triticum aestivum)，玉米(Zea may)，部分观赏园艺作物例如番红花(Crocus sativus)和黄瓜(Cucumis sativus)等植物上成功运用。基于菊属植物中的参考基因组菊花脑(Chrysanthemum nankingense)和甘野菊(C.seticuspe)的基因组数据，加上春黄菊族中的近缘属中的黄蒿(Artemisia annua)和向日葵(Helianthus annuus)基因组数据，我们拟通过拟南芥(Arabidopsis thaliana)5S rDNA和45S rDNA (5.8S,18S,26S)序列与上述数据库进行比对，利用获得的共有序列开发相应的5S rDNA和45SrDNA寡核苷酸探针，以期获得高分辨率的菊属植物5S rDNA和45S rDNA FISH核型信息，从而明晰菊属内各种核糖体DNA位点的差异。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是针对目前在菊属植物分子细胞遗传学研究中，采用传统荧光原位杂交技术中使用的异源5S rDNA和45S rDNA进行分析时，探针制备方法和过程繁琐，成本较高，且信号易受异源片段的干扰，难以识别的问题，提供基于菊属植物及其近缘属参考基因
组数据的 5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针开发方法和探针套，从而明晰菊属下各种的差异，实用性和科学性突出。
[0006]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA的寡核苷酸混合探针套，所述寡核苷酸混合探针套包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的5S rDNA寡核苷酸探针套和SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.12所示的45S rDNA寡核苷酸探针套，所述寡核苷酸混合探针套序列特征如下：
[0008]①
5S rDNA寡核苷酸探针套
[0009][0010]②
45S rDNA寡核苷酸探针套
[0011][0012][0013]本专利技术的第二个目的是提供一种包含前述寡核苷酸混合探针套的寡核苷酸探针套杂交液，所述寡核苷酸探针套杂交液每个制片使用量成分包括：dFA 7.5μL，20
×
SSC 1.5μL，Salmonsperm DNA(鲑鱼精DNA)0.5μL，体积百分比50.0％Dextran Sulfate(硫酸葡聚糖)1.5μL，前述寡核苷酸混合探针套6.0μL；将所述成分于1.5mL或2.0mL或离心管中混匀，振荡离心后置于105℃的加热块中变性10-13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min以上，制备得到所述寡核苷酸探针套杂交液。
[0014]进一步的，所述寡核苷酸混合探针套中，各探针浓度为：JH 5SrDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5SrDNA-2(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-1 (0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-1 (0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-4 (0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-5(0.55ng/μL)。各探针加入量均为0.5μL。
[0015]本专利技术的第三个目的是提供一种利用前述寡核苷酸探针套杂交液的开发方法：
[0016]利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地
Blast 比对。分别通过5S、5.8S、18S和28S rDNA序列比对获得共有序列(共有序列如SEQ IDNO.13至SEQ ID NO.16所示)。5S、5.8S、18S和28S rDNA的共有序列长度分别为123bp、 164bp、952bp、3402bp。5S rDNA的编码序列在菊花脑、甘野菊、黄蒿显示出高度的相似性。
[0017]为了获得代表性的5S rDNA探针，利用获得的共有序列进行多序列比对来设计5S rDNA探针。比对结果显示，5S rDNA的编码序列菊花脑、甘野菊和黄蒿中较为保守。合成的5S rDNA 寡核苷酸探针套，包含两条双端TAMRA修饰的寡核苷酸探针(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 所示)。
[0018]而对于45S rDNA,其主要部分5.8S，18S，28S(26S)序列在所比对物种中存在明显的变异。合成45S rDNA的寡核苷酸探针套，包含根据其不同单元设计的3`端FAM修饰的寡核苷酸探针10条(SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.12所示)。除此之外，多序列比对结果可以看出，45S rDNA 的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套，其特征在于，所述寡核苷酸混合探针套包括5S rDNA寡核苷酸探针套和45S rDNA寡核苷酸探针套，所述5S rDNA寡核苷酸探针套和45S rDNA寡核苷酸探针套序列特征如下：
①
5S rDNA寡核苷酸探针套
②
45S rDNA寡核苷酸探针套2.包含权利要求1所述寡核苷酸混合探针套的寡核苷酸探针套杂交液，其特征在于，所述寡核苷酸探针套杂交液每个制片使用量成分包括：dFA 7.5μL，20
×
SSC 1.5μL，Salmon sperm DNA 0.5μL，体积百分比50.0％Dextran Sulfate 1.5μL，权利要求1所述寡核苷酸混合探针套6.0μL；将所述成分于1.5mL或2.0mL离心管中混匀，振荡离心后置于105℃加热变性10-13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min以上，制备得到所述寡核苷酸探针套杂交液。3.根据权利要求2所述的寡核苷酸探针套杂交液，其特征在于，所述寡核苷酸混合探针套中，各探针浓度为：JH 5SrDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-4(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-5(0.55ng/μL)；各探针加入量均为0.5μL。4.一种权利要求1所述寡核苷酸探针套的开发方法，其特征在于，所述开发方法包括以下步骤：(1)利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对；再利用Jalvi...
【专利技术属性】
技术研发人员：王海滨，何俊，陈发棣，林思思，房伟民，陈素梅，宋爱萍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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