一种修饰的核苷酸，组合物及试剂制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种修饰的核苷酸，组合物及试剂，本发明专利技术公开的修饰的核苷酸，可以在两个位置分别或同时取代，选择范围广，且将修饰的acyATP应用到质谱SNP的检测中，保证单碱基延伸酶延伸效率的同时，使得产物分子量区分开，提高质谱分辨率，保证结果判读的准确性，本发明专利技术公开了一种核酸质谱检测的新思路，对于核酸质谱检测具有重大意义。对于核酸质谱检测具有重大意义。对于核酸质谱检测具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种修饰的核苷酸，组合物及试剂
专利

[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种修饰的核苷酸，组合物及试剂。
[0002]专利技术背景
[0003]单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在人 群中发生的频率高于1％，是人类可遗传的变异中最常见的一种，因此，SNP的检测对遗传病的诊断、筛 查以及用药等方面有及其重要的指导作用。
[0004]目前，SNP检测的方法学主要包含实时荧光PCR法、PCR基因芯片法、PCR电泳法、PCR毛细电泳 法分析法、PCR高分辨溶解曲线法、流式荧光杂交法、飞行时间质谱法，焦磷酸测序法、Sanger测序法等。 其中，实时荧光PCR法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法和流式荧光杂交 法的优点在于耗时较短、灵敏度较高，能够实现某些场景下的检测，但因其通量有限，所以无法方便快捷 地满足临床对于数十个甚至数百个基因位点的检测需求。基因芯片法、焦磷酸测序法和Sanger测序法，虽 然检测较为准确，但检测成本较高，耗时较长，并不是SNP检测的首要选择。而飞行时间质谱法，检测速 度快，数据分析简单，通量较高，即弥补了传统方法学的不足，又降低了成本，相比前面几种方法是一种 更好的选择，但却存在检测结果不够准确的问题，使其应用的进一步发展受到了限制。
[0005]核酸质谱SNP检测主要基于PCR和引物延伸技术，其原理是首先通过PCR引物对待检测SNP位点 的目标片段进行扩增，产生的PCR产物经过虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)处理中和残 留dNTPs。SAP消化反应结束后，向反应液中加入缓冲液，延伸引物，dideoxynucleotide(ddNTPs)以及 单碱基延伸酶等组分进行引物延伸反应。以DNA扩增产物为模板，延伸引物可与待检测SNP位点的5
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端结合，延伸一个碱基。引物延伸完成后，向反应液中加入阳性数值进行脱盐处理，去除吸附在核酸片段 上的金属离子。脱盐完成后，将样品与基质转移到靶板形成共结晶，通过质谱检测获得谱图。通过计算谱 图中产物的分子量与延伸引物的分子量的差值可分析该样品SNP位点的分型。
[0006]然而，以ddNTP作为底物时，单碱基延伸酶的结合效率低，延伸效果差，影响谱图结果判断的准确性。 另外一种可用于单碱基延伸的核苷酸底物为线性核苷酸(acyclonucleotides，acyNTP)，将dNTP中常见的 2
′‑
deoxyribofuranosyl sugar替换为2
‑
hydroxyethoxymethyl group(如图1)。DNA聚合酶对于acyNTP的识 别效率为普通ddNTP的30倍(参考文献：Gardner,A.,and Jack,W.(2002).Acyclic and dideoxy terminatorpreferences denote divergent sugar recognition by archaeon and Taq DNA polymerases.Nucleic Acids Res.30, 605
–
613.doi:10.1093/nar/30.2.605)。
[0007]
技术实现思路

[0008]本专利技术为了解决核酸质谱SNP检测中因为延伸效果差，带来的检测结果不准确的问题，采用acyNTP 代替传统的ddNTP作为底物,利用分子量差值可分析SNP位点分型的原理，对核苷酸进行修饰，公开了一 种修饰的核苷酸，所述核苷酸的结构如下：
[0009][0010]其中X1和X2相同或不同，各自独立选自H，C1‑
C
20
烷基、C3‑
C
10
环烷基、C2‑
C
10
烯基、C2‑
C
10
炔基、 芳基、杂芳基或杂环基；
[0011]所述C1‑
C
20
烷基、C3‑
C
10
环烷基、C2‑
C
10
烯基、C2‑
C
10
炔基、芳基、杂芳基或杂环基任选被取代基取 代或未取代；
[0012]所述取代基为一个或多个，各自独立选自氨基、卤素、羟基或巯基；
[0013]n为1
‑
12整数；
[0014]A选自CH2或O；
[0015]所述修饰的核苷酸分子量为474
‑
933Da。
[0016]优选的，所述修饰的核苷酸分子量为481
‑
933Da。
[0017]现有技术中acyNTP作为底物主要应用于测序，在核酸质谱SNP检测中应用较少。acyNTP作为底物时， acyCTP、acyATP、acyGTP和acyTTP分子量分别为425.12、449.12、465.14、440.1。
[0018]其中acyATP与acyTTP核苷酸之间分子量的差异为9Da然而质谱仪很难有效区分9Da差异的特征峰， 尤其在大分子量检测区间如7000Da
‑
12000 Da，从而导致部分SNP类型无法精准区分，只有分辨率特别好 的质谱仪，能够实现9Da的分辨，而普通质谱仪，分子量相差16Da时，能够轻易且准确的进行区分。所 以本专利技术在acyATP上进行修饰以改变其分子量，选择分子量474Da以上，优选481Da以上的核苷酸， 保证了单碱基延伸酶对核苷酸底物高效识别的同时，使得各个核苷酸之间分子量可以区分，提高谱图分辨 率与结果判读准确率。
[0019]核酸质谱利用分子量进行核酸分型，所以当修饰的核苷酸的分子量越大，四个核苷酸底物的分子量相 差越大，谱图分辨更容易，所以对修饰的acyTTP上限并没有特别的限定，但考虑到小分子检测，过大的 分子量合成困难，成本较高，普通小分子一般选择933Da
以下就足够了。本专利技术分子量控制在933Da以 下，所述933Da是通过当A＝O，n＝12时，X1和X2为H时，计算得出的。
[0020]作为优选，所述烷基选自C1‑
C
10
的直链或支链的取代或未取代的烷基；所述烷基可被氨基、卤素、羟 基或巯基取代；
[0021]作为优选，所述烯基选自C2‑
C8的直链或支链的取代或未取代的烯基；所述烯基可被卤素取代；
[0022]作为优选，所述炔基选自C2‑
C5的直链或支链的取代或未取代的炔基；所述炔基可被羟基取代；
[0023]作为优选，所述芳基选自取代或未取代的苯基；所述苯基可被氨基或卤素取代；
[0024]作为优选，所述杂芳基选自作为优选优选5到10元杂芳基，例如，呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑 基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡喃基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基；
[0025]作为优选，所述杂环基选自饱和杂环基，优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的结构如下：其中X1和X2相同或不同，各自独立选自H，C1‑
C
20
烷基、C3‑
C
10
环烷基、C2‑
C
10
烯基、C2‑
C
10
炔基、芳基、杂芳基、羧基或杂环基；所述C1‑
C
20
烷基、C3‑
C
10
环烷基、C2‑
C
10
烯基、C2‑
C
10
炔基、芳基、杂芳基或杂环基任选被取代基取代或未取代；所述取代基为一个或多个，各自独立选自氨基、卤素、羟基或巯基；n为1
‑
12整数；A选自CH2或O；所述修饰的核苷酸分子量为474
‑
933Da。2.如权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸分子量为481
‑
933Da。3.如权利要求1或2所述的核苷酸，其特征在于，所述烷基选自C1‑
C
10
的直链或支链的取代或未取代的烷基；所述烯基选自C2‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶彬彬，刘丰，徐娅，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：