供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，公开了供者特异性IL

【技术实现步骤摘要】
供者特异性IL
‑
21和IFN
‑
γ
的检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及供者特异性IL
‑
21和IFN
‑
γ的检测方法及应用。

技术介绍

[0002]随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时常用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索疾病发病机制，用于疾病的诊断和疗效判断具有重要意义。ELISPOT目前最常用于病毒特异性细胞和细胞因子的检测，但是在器官移植领域的应用相对较少，并且还未见供者抗原刺激受者细胞产生细胞因子的相关检测方案。因此，专利技术人专利技术供者特异性IL
‑
21和IFN
‑
γ的检测方法及应用。

技术实现思路

[0003]基于以上问题，本专利技术提供供者特异性IL
‑
21和IFN
‑
γ的检测方法及应用。
[0004]为解决以上技术问题，本专利技术提供了供者特异性IL
‑
21和IFN
‑
γ的检测方法，包括如下步骤：
[0005]S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；
[0006]S2：检测供者特异性IL
‑
21
[0007](1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20min，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
[0008](2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
[0009]A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
[0010]B：100μl 3x105受者细胞+100μl3x105灭活的供者细胞
[0011]C：100μl 3x105受者细胞+100μl3x10
53rd
party灭活的供者细胞
[0012]D：100μl 1x105受者细胞+100μl ICE 10x
[0013]E：100μl 5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
[0014]F：100μl 5x104受者细胞+100μl PHA5μg/mL
[0015]G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
[0016]H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
[0017]于37℃、5％CO2条件下孵育44小时；
[0018](3)稀释生物素标记检测抗体：9mL PBS
‑
I+1mL 10x稀释缓冲液+100μl生物素标记检测抗体；250μl PBS
‑
I洗涤5次；加入100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS
‑
I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；室温孵育1小时，封闭；PBS
‑
I双面洗板5次；加入100μl AEC底物液，室温避光孵育30分钟，洗板，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数；
[0019]S3：检测IFN
‑
γ
[0020](1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者20min，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；
[0021](2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：
[0022]A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液
[0023]B：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x105灭活的供者细胞
[0024]C：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x10
53rd
party灭活的供者细胞
[0025]D：100μl 5x104受者细胞+100μl ICE 10x
[0026]E：100μl 2.5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mL
[0027]F：100μl 2.5x104受者细胞+100μl PHA 5μg/mL
[0028]G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
[0029]H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞
[0030]于37℃、5％CO2条件下孵育20小时；
[0031](3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS
‑
I+1mL稀释缓冲液(10x)+100μl生物素标记检测抗体；250μl PBS
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I洗涤2次，250μl PBS
‑
Tween洗涤5次；加100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS
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I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育2小时，封闭；PBS
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Tween双面洗板5次；加入100μl AEC底物液，室温避光孵育25分钟；去离子水冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。
[0032]进一步的，步骤S2和步骤S3中的供者细胞接受辐射时，受者细胞至于37℃孵箱中保存，盖子不宁紧，确保受者细胞活性。
[0033]进一步的，步骤S2(3)和步骤S3(3)中的样本均进行三次重复检测，取平均值，阳性质控大于50个细胞/孔，质控合格。
[0034]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了检测方法在评估器官移植受者术前和术后免疫系统的致敏程度或预测肾移植术后急性和慢性排斥反应发生几率的产品中的应用。
[0035]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术基于ELISPOT和相关细胞因子检测试剂，分离提纯器官移植供者和受者外周血单个核细胞，辐照灭活供者细胞，使其不能产生细胞因子，但保留其抗原性，本专利技术可实现分泌供者特异性细胞因子的受者细胞的检测，通过本专利技术可检测器官移植术后供者抗原刺激活化的受者IL
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21或IF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.供者特异性IL
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21和IFN
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γ的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；S2：检测供者特异性IL
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21(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x106/mL；(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：A：100μl 3x105受者细胞+100μl细胞培养液B：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x105灭活的供者细胞C：100μl 3x105受者细胞+100μl 3x10
53rd
party灭活的供者细胞D：100μl 1x105受者细胞+100μl ICE 10xE：100μl 5x104受者细胞+100μl SEB 100ng/mLF：100μl 5x104受者细胞+100μl PHA5μg/mLG：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞于37℃、5％CO2条件下孵育44小时；(3)稀释生物素标记检测抗体：9mL PBS
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I+1mL 10x稀释缓冲液+100μl生物素标记检测抗体；250μl PBS
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I洗涤5次；加入100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS
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I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；室温孵育1小时，封闭；PBS
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I双面洗板5次，加入100μl AEC底物液，室温避光孵育30分钟，洗板，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数；S3：检测IFN
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γ(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用...

【专利技术属性】
技术研发人员：严琳，李壹，白杨娟，李亚梅，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：