一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的分子标记和引物以及方法与应用技术

本发明专利技术一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的分子标记和引物以及方法与应用，属于水产动物分子遗传学。一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕(Lota lota)的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，所述引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。在基因层面上提供了一种黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域的江鳕鉴定方法，有效的避免了外观形态难以区分、背景来源不明确及加工形态破坏等造成的难以鉴定区分的问题，具有简便、快速、高效、准确的优点。准确的优点。准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的分子标记和引物以及方法与应用


[0001]本专利技术属于水产动物分子遗传学
，具体涉及一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的分子标记和引物以及方法与应用。

技术介绍

[0002]江鳕(Lota lota)隶属鳕形目Gadiformes、鳕亚目Gadoidae、鳕科Gadidae、江鳕属Lota，俗称山鲶鱼。主要分布于北半球高纬度冷水江河和湖泊中，是鳕科鱼类中唯一的在淡水中生活的物种，在我国主要分布于黑龙江流域和额尔齐斯河流域。江鳕属大型鱼类，肉质细腻、无肌间刺蛋白和脂类含量丰富，其肝脏较大(占体重的6
‑
9％)，可制作鱼肝油，是重要的冷水性经济鱼类。
[0003]由于黑龙江流域、额尔齐斯河流域的水系不具有连通性，两个流域内的江鳕无法进行有效的基因交流，随着地理隔离的时间延长，黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕已经形成两个相对独立的系统发育类群和种质资源。种质资源是开展优良品种选育的基础，是推进生态保护修复和农业高质量发展的关键资源。随着天然水域不断受到人类活动的影响，如水利工程的修建、水污染等，江鳕野生资源急剧下降，为有效恢复两个流域江鳕野生种质资源数量，渔业渔政管理部门积极开展野生江鳕的增殖放流活动。为了避免增殖放流过程中，江鳕增殖放流亲本的来源不明，进而导致两个流域水系的野生种质发生混杂，现急需建立一种快速准确有效区分两个流域江鳕种质资源的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了建立一种准确且快速鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕方法。
[0005]本专利技术提供了一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的SNP分子标记，其所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
[0006]本专利技术提供一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的引物，所述引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
[0007]本专利技术提供一种鉴定黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的试剂盒，含有上述的引物。
[0008]本专利技术提供一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的方法，所述方法如下：
[0009](1)提取待测样本的基因组DNA；
[0010](2)以步骤(1)所述的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0011](3)利用限制性内切酶NlaIII对PCR扩增产物进行酶切，获得酶切产物，对酶切产物进行电泳检测，如果电泳条带大小为111bp单条带的个体为黑龙江流域江鳕，如果电泳条
带大小为30bp和81bp两条带或81bp一条带的个体为额尔齐斯河流域江鳕。
[0012]进一步地限定，步骤(2)所述PCR反应的条件为95℃变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，再72℃延伸3min，4℃保温。
[0013]进一步地限定，步骤(2)所述PCR反应的体系为：DreamTaq 25μL 2
×
PCR Master Mix、19μL无DNA酶水、2μL 10μM引物SEQ ID NO:3、2μL 10μM引物SEQ ID NO:4和2μL50ng/μL DNA模板。
[0014]进一步地限定，步骤(3)所述酶切反应条件为：37℃水浴酶切30min，80℃水浴终止反应5min。
[0015]进一步地限定，步骤(3)所述酶切反应体系为：17μL无DNA酶水、2μL 10
×
FastDigest Green buffur、10μL PCR扩增产物和1μL NlaIII限制性内切酶。
[0016]进一步地限定，步骤(3)所述电泳采用的是3％的琼脂糖凝胶或8％聚丙烯酰胺凝胶。
[0017]本专利技术提供上述的分子标记、上述的引物或上述试剂盒在黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕种质资源鉴定中的应用。
[0018]有益效果：采用本专利技术鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕种质资源的分子遗传学方法，从线粒体基因层面对进行鉴别，从而避免了通过外部形态判断两个流域江鳕种质存在的不准确、容易混淆的问题。
[0019]本专利技术所设计的江鳕线粒体分子标记的引物，在黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕中具有良好的保守型，PCR产物长度均为111bp，其中仅包含一个碱基的差异，该差异位点能够被限制性内切酶NlaIII所识别，将额尔齐斯河流域江鳕线粒体标记PCR产物切割成30bp和81bp两个DNA片段，但是对黑龙江流域江鳕线粒体标记PCR产物不起作用。
[0020]利用本专利技术的引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，以待检测样本的DNA为模板，扩增得到的产物利用限制性内切酶(NlaIII)酶切，酶切产物片段的大小范围在30bp
‑
111bp，通过与含有100bp长度的DNA分子量marker比较，能够准确且快速的鉴定大于100bp条带的个体为黑龙江流域江鳕，小于100bp条带的个体为额尔齐斯河流域江鳕。
附图说明
[0021]图1为实施例1利用引物LLC1
‑
3F和LLC1
‑
3R对黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕样本进行PCR扩增并进行酶切后的3％琼脂糖电泳图；H
‑
1、H
‑
2、H
‑
3和H
‑
4为黑龙江流域江鳕电泳图；M为DL2000 marker；X
‑
1、X
‑
2、X
‑
3和X
‑
4为额尔齐斯河流域江鳕电泳图。
[0022]图2为实施例1利用引物LLC1
‑
3F和LLC1
‑
3R对黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕样本进行PCR扩增并进行酶切后的8％聚丙烯酰胺电泳图；H
‑
1、H
‑
2、H
‑
3和H
‑
4为黑龙江流域江鳕电泳图；M为Thermo Scientific GeneRuler 50bp DNA分子量标准；X
‑
1、X
‑
2、X
‑
3和X
‑
4为额尔齐斯河流域江鳕电泳图。
具体实施例
[0023]实施例1.鉴定黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的方法
[0024]一、基因序列为线粒体基因
[0025]黑龙江流域江鳕序列如SEQ ID NO:1。
[0026]TGTCCTCTCTATAGGAGCCGTCTTTGCTATCATAGCAGCTTTTGTTCACTGATTCCCGCTGTTTACAGGCTATACTCTCCACGACACCTGAACAAAAATCCACTTTGGGGT
[0027]额尔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。2.一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。3.一种鉴定黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物。4.一种鉴别黑龙江流域江鳕和额尔齐斯河流域江鳕的方法，其特征在于，所述方法如下：(1)提取待测样本的基因组DNA；(2)以步骤(1)所述的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；(3)利用限制性内切酶NlaIII对PCR扩增产物进行酶切，获得酶切产物，对酶切产物进行电泳检测，如果电泳条带大小111bp单条带的个体为黑龙江流域江鳕，如果电泳条带大小为30bp和81bp两条带或81bp一条带的个体为额尔齐斯河流域江鳕。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR反应的条件为95℃变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾培贤，户国，董晓丽，张晓峰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：