一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法技术

本发明专利技术提供一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，具体为干预非编码RNANORAD。本发明专利技术提供的抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，首次提出以干预非编码RNANORAD来抑制间盘退变中髓核细胞衰老，并通过实验加以证明，具有很强的现实意义。很强的现实意义。很强的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法


[0001]本专利技术涉及医疗领域，尤其涉及一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法。

技术介绍

[0002]腰椎间盘退变性疾病是下腰痛的主要原因，在现代社会极为常见，80％的人一生中曾经历过下腰痛，是成人劳动力丧失的第3位原因。全球每年有570多万人被诊断患有该病，其中以45～64岁之间发病率最高(4.6/100人)，且随年龄增长有明显上升的趋势，造成了沉重的社会负担。然而椎间盘退变目前尚无有效的靶向性治疗措施。
[0003]髓核细胞是椎间盘重要的组成细胞，髓核细胞衰老在椎间盘退变过程中发挥着重要作用，因此明确椎间盘退变中髓核细胞衰老的具体机制，对于治疗和预防椎间盘退变有着重要意义。
[0004]非编码RNA在调控细胞生理活动及病理变化中发挥重要作用，葡萄牙里斯本大学药物分子研究所(Instituto de MedicinaMolecular，iMM)的研究人员发现操纵单一RNA分子就能逆转细胞衰老(原文检索：
[0005]Silencing ofthe lncRNAZeb2
‑
NAT facilitates reprogramming ofaged fibroblasts and safeguards stem cell pluripotency)。因此探索椎间盘退变过程中非编码RNA在髓核细胞衰老中的调控作用及机制，并通过相应的干预策略，可明确通过非编码RNA的靶向可否缓解椎间盘中髓核细胞的衰老。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，以解决上述技术问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，所述方法为：干预非编码RNA NORAD。
[0009]优选的是，所述干预非编码RNANORAD的方法具体为：利用TNFα处理正常的髓核细胞。
[0010]本专利技术具有以下有益效果：
[0011]1、通过实验证明椎间盘退变中髓核细胞衰老伴有NORAD表达水平降低，抑制正常细胞中的NORAD的表达，会促进髓核细胞衰老，在衰老髓核细胞中过表达NORAD，可以抑制髓核细胞衰老；
[0012]2、首次提出以干预非编码RNANORAD来抑制间盘退变中髓核细胞衰老，并通过实验加以证明，具有很强的现实意义。
附图说明
[0013]图1是正常和退变的髓核组织二代测序结果分析图。
[0014]图2是利用TNFα处理后的髓核细胞NORAD的表达量图。
[0015]图3是荧光实验证实TTNFα处理后的髓核细胞NORAD的表达量图。
[0016]图4是组织学FISH实验证实TTNFα处理后的髓核细胞NORAD的表达量图。
[0017]图5是髓核细胞衰老的指标对比图。
[0018]图6是荧光实验证实TTNFα处理后的髓核细胞NORAD的表达量图。
具体实施方式
[0019]以下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0020]本专利技术可以有许多不同的形式实施，而不应该理解为限于在此阐述的实施例，相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的。
[0021]如图1所示，在实施本实施例前，从正常人和病变病人取出正常和退变的髓核组织储存在RNAlater保存液中，然后用组织剪剪碎，体积平均小于1cm3，离心后加入0.4％二型胶原酶37度消化5小时，制备单细胞悬液，然后1200rpm离心5分钟后，利用TRizol提取说明步骤提取髓核细胞中的RNA，提取后的RNA进行建库，然后进行二代测序，然进行上机扩增，比对，以及分析等。分析在正常组和退变组中存在差异且最为明显的非编码RNA，具体RNA提取和测序过程皆为本领域较常见手段，为本领域人员所熟知，故在本实施中不在赘述。如图1所示，测序发现非编码RNANORAD存在的差异最为明显:测序结果显示，退变的髓核细胞中NORAD的表达量显著低于正常组的髓核细胞。
[0022]如图2所示，在实施例1中，可利用20uM的人源性TNFα处理正常的髓核细胞48h作为髓核细胞衰老的造模方式，发现TNFα(肿瘤坏死因子，英文名称：tumornecrosis factor；TNF，主要由活化的单核/巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬，抗感染，引起发热，诱导肝细胞急性期蛋白合成，促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。)处理后的衰老的髓核细胞中，NORAD的表达量显著降低。说明在衰老的髓核细胞中，NORAD变化与退变的人组织标本中髓核细胞的变化是一致的。
[0023]如图3所示，在实施例2中，利用RNA SCOP实验，根据ACD的RNAScop试剂盒说明，进行RNAScop实验。首先将种植在细胞爬片上的细胞在4％的多聚甲醛中固定半小时，然后利用PBS清洗3次，每次5分钟。其次用0.5％Triton加入细胞中对细胞进行通透20分钟，然后0.5％TBST清晰3次，每次5分钟。然后利用免疫荧光封闭液进行封闭30分钟，后用吸水纸吸干封闭液，加入NORAD荧光探针4度封闭过夜。第二天利用TBST将爬片避光清洗3次，然后滴上含有DAPI的荧光防淬灭剂后在荧光显微镜下进行观察。将NORAD染成红色，细胞核染成蓝色，利用荧光亮度进一步证实在TNFα处理后的衰老的髓核细胞中，NORAD的表达量显著降低。
[0024]如图4所示，在实施例3中，利用组织学FISH实验，取新鲜的髓核组织即刻在组织杂交固定液中固定30分钟，然后进行组织切片制片，其次用0.5％Triton加入细胞中对组织进行通透20分钟，然后0.5％TBST清晰3次，每次5分钟。然后利用免疫荧光封闭液进行封闭30分钟，后用吸水纸吸干封闭液，加入NORAD荧光探针4度封闭过夜。第二天利用TBST将玻片组织避光清洗3次，然后滴上含有DAPI的荧光防淬灭剂后在荧光显微镜下进行观察。在正常和退变的髓核组织中将NORAD染成红色，细胞核染成蓝色，利用荧光亮度进一步证实在退变的髓核组织中的髓核细胞里，NORAD的表达量显著降低。
[0025]如图5所示，在实施例4中，在正常的髓核细胞和TNFα处理后的衰老髓核细胞中，分别构建NORAD的过表达质粒和基因敲减慢病毒进行细胞转染，达到抑制和过表达NORAD基因的水平的目的。慢病毒转染前18
‑
24小时，将髓核细胞以1
×
105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2
×
105/孔左右。
[0026]第二天，用含有6μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。转然后48小时候，通过荧光显微镜观察病毒转染效率。然后通过Westernblot实验检测基因过表达或敲减的水平，以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制间盘退变中髓核细胞衰老的方法，其特征在于，所述方法为：干预非编码RNANORAD。2.根据权利要求1所述的一种抑制间...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨操，李高才，张伟锋，宋雨，罗荣锦，梁怀真，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：