一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法技术

本发明专利技术公开了一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，涉及生物技术领域。包括以下步骤：S1果蝇幼虫待转染组织器官的制备；S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，对依次经孵育转染混合液A执行转染、孵育预培养液B稳定转染和使用全培养液C进行转染后的组织器官常规培养；S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果。本发明专利技术可以直接转染果蝇幼虫组织器官，48h可观测到果蝇组织器官实现外源基因的转染和成功表达，因技术方案实行12小时换液规则，并且果蝇组织器官培养为25℃，因此微生物污的增殖速度远远达不到污染程度，适用于有菌操作环境。操作环境。操作环境。

【技术实现步骤摘要】
一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法。

技术介绍

[0002]转染(transfection)是体外或体内细胞经过相应的生物技术处理，主动或被动导入外源DNA或RNA片段，继而在细胞内进行蛋白表达或获得新表型的过程(如RNAi)。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染，前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，宿主细胞中可同时存在多拷贝核酸，因此表达水平高，且通常只能维持数天表达，后者亦称作稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为游离体存在。
[0003]现代的转染方法分为：化学法、物理法和病毒转染法。其中，化学法包括：磷酸钙法、DEAE
‑
葡氨聚糖法和脂质体法等；物理法包括：显微注射、电穿孔和基因枪等方法；化学法除磷酸钙法，其它类型均需要借助商品化转染试剂，该类试剂由于价格高，用量大，导致单次转染成本较高，另外，商品化转染试剂只能对细胞级别样本进行转染，而对组织无效；而物理法则需要显微注射仪、电转染仪、基因枪等昂贵仪器；病毒转染法需要商品化病毒或自包装病毒，操作流程繁琐，并且现有腺病毒类转染载体等对果蝇细胞组织无效。
[0004]同时，现有技术中，常规转染过程一般只对生长期的细胞级别样品进行操作，所以需要高标准的无菌细胞培养环境，并且对增殖分裂能力差的突变体细胞株和体积较大的组织团块几乎无效，进一步增加了转染成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供的一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
[0006]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用以下技术方案：
[0007]一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，包括以下步骤：
[0008]S1果蝇幼虫组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于PBST中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌PBS清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；
[0009]实验中可使用普通饲养条件下的果蝇三龄幼虫，如在无菌或减菌条件下饲养能够减小意外污染概率。
[0010]S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液A，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液A，并使用PBS快速清洗，再加入预培养液B，25℃培养4～6小时；将预培养液B更换为全培养液C，进行培养；一般每孔可培养并转染5只以内的幼虫组织器官；
[0011]S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；
[0012]其中，转染混合液A的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul 5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为SHIELDS AND SANG M3INSECT MEDIUM昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；
[0013]昆虫培养基分装成1ml和丙酮酸钠浓储
‑
20℃冻存，使用前溶化至室温；谷氨酰胺和三种蛋白酶抑制剂浓储液冻分装后存于
‑
80℃，临时使用时少量转存至
‑
20摄氏度，一个月内使用，过期丢弃；60％乳酸钠储存液4摄氏度保存；
[0014]洋地黄苷浓储液保存至
‑
80℃条件下，
‑
20℃3个月有效；
[0015]预培养液B的制备方法按如下比例：向100ul SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入200ng待转染质粒；
[0016]全培养液C的制备方法按如下比例：向主体为SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入培养液，其中，每900ul培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠、10ul 100X(最好能有一个确定的浓度，专利中基本不允许有这种模糊的概念)的青霉素和链霉素双抗浓储液和100ul胎牛血清。
[0017]全培养液放置于4℃冰箱，使用前平衡至室温，用后再放回冷藏即可。
[0018]其中，本专利技术中，所述步骤S1中，每组果蝇幼虫数量不超过5只，用PBST反复清洗果蝇幼虫外表3次，在含有灭菌PBS的培养皿中解剖。
[0019]所述步骤S2中，解剖后果蝇组织器官使用PBS快速清洗两次，每次清洗过程如下：利用PBS清洗液进行10次逐滴清洗，且每两次清洗并转移组织器官后，对镊子进行火焰消毒并在空气中冷却待用。
[0020]具体操作可以为：在培养皿中滴入10滴PBS，其中，每滴为60
‑
80ul左右，解剖完成后，再逐滴清洗果蝇幼虫各组织器官，使得果蝇幼虫各组织器官表面和间隙中的可能污染物尽量被洗净，操作用镊子酒精灯火焰消毒冷却后使用，且每两滴清洗后，镊子需消毒一次。
[0021]进一步的，所述灭菌PBST清洗液中的制备方法为在每100mlPBS添加100ul TritonX100。
[0022]本专利技术中，所述PBS的制备按如下比例：取磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，121℃高温高压灭菌20分钟，冷却后备用。
[0023]优选的，所述步骤S2中，转染混合液A的加入量至少为50ul，在摇床上慢速转染的时间为30min
‑
1h。
[0024]优选的，所述步骤S2中，全培养液C的使用每12小时换液一次，且换液至少3次，保障全培养液C的培养总时间达到48小时，并于每次换液时用室温PBS至少清洗一次。
[0025]进一步的，所述步骤S2中，混合转染液A与预培养液B中转染Arm
‑
Gal4 100ng和UAS
‑
GPI
‑
GFP 100ng质粒，总转染质粒质量为200ng。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0027]1、本专利技术利用化学细胞膜穿孔剂洋地黄苷(digitonin)辅助以其它蛋白酶抑制、辅助培养试剂进行果蝇幼虫组织器官细胞膜、核膜的直接打孔穿透，使待表达质粒直接渗
透到细胞核内进行表达，无需依赖细胞分裂来进行转染表达，因此适用于有增殖和分裂障碍的细胞系和果蝇品系，可以进行果蝇幼虫组织器官级别转染，无需消化成单细胞；
[0028]2、本专利技术的培养基中，增加能量代谢物质谷氨酰胺、丙酮酸和乳酸钠，使果蝇幼虫组织细胞活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于，包括以下步骤：S1果蝇幼虫待转染组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于PBST中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌PBS清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液A，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液A，并使用PBS快速清洗，再加入预培养液B，25℃培养4～6小时；将预培养液B更换为全培养液C，进行培养；S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；其中，转染混合液A的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul 5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；预培养液B的制备方法按如下比例：向100ul SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入200ng待转染质粒；全培养液C的制备方法按如下比例：向主体为SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入培养液，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，叶晓蕾，冯颖，林益，林雪，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：