一种筛选LO2细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选LO2细胞的方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术的筛选LO2细胞的方法包括以下步骤：在LO2细胞中先后加入具有第一浓度的抗生素和第二浓度的抗生素进行培养；所述第一浓度的抗生素能够富集细胞，所述第二浓度的抗生素能够筛选细胞。本发明专利技术的筛选LO2细胞的方法能够快速的筛选出阳性转化的LO2细胞，避免高浓度抗生素杀死阳性转化株和低浓度抗生素产生大量假阳性，节约了实验时间。间。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选LO2细胞的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种筛选LO2细胞的方法。

技术介绍

[0002]目前瞬时转染是细胞中最常用的转染技术之一，瞬时转染虽然能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白；实验成本低；一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高等特点。但是其外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产。
[0003]慢病毒感染细胞可以得到稳定表达的细胞系，而且稳定转染是外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，能够长期稳定的生产目的蛋白。通过稳定转染(稳定细胞系构建)能够实现长期、稳定的生产重组蛋白，得到稳转株，后续生产蛋白的成本降低能够对基因进行基因插入、基因敲除等编辑操作。使用慢病毒感染细胞后需要对细胞进行筛选，嘌呤霉素常用于转染细胞进行筛选。嘌呤霉素是一种由白黑链霉菌产生的氨基苷类抗生素。在原核和真核细胞中，嘌呤霉素都是强效翻译抑制剂，它具有与tRNA分子末端类似的结构，能够共价连接到核糖体延长的多肽链上，从而产生不成熟的多肽链，使蛋白翻译过早终止。此外有研究表明，嘌呤霉素诱导的细胞凋亡并不归因于抑制蛋白合成，而是通过抑制调控细胞分裂周期的氨肽酶，导致细胞在G/M期积累，最终抑制了细胞分裂进程诱导其凋亡。如果嘌呤霉素抗性基因被引入动物细胞并表达相关的酶活性，则细胞可以在嘌呤霉素环境下存活。嘌呤霉素抗性基因被用作在抗生素选择下能够生长的转染哺乳动物细胞的主要标记物。不同于遗传霉素(G418)和湿霉素，嘌呤霉素作用迅速，低浓度嘌呤霉素即可快速导致细胞死亡，因此常用嘌呤霉素进行瞬态选择。嘌呤霉素筛选浓度过高容易杀死阳性转化株，浓度过低又不易杀死阴性转染细胞，筛选时间过长或过短都不易于阳性转化株的筛选。嘌呤霉素处理观察时间通常为3～5天，为保证杀死所有阴性细胞株，通常将药物的筛选浓度提高为原来的2倍作为最佳筛选浓度。由于细胞种类不同，嘌呤霉素筛选的最佳浓度有所不同，不同厂家及批次的嘌呤霉素浓度也有所差异，因此需要进行浓度梯度实验摸索转染的最佳嘌呤霉素筛选浓度。
[0004]LO2细胞是人正常肝细胞，具有典型的肝细胞形态学特征，可用于多种实验研究，近年来在生物医药领域中逐渐引起关注。解决LO2细胞池的构建问题，对于使用LO2细胞作为宿主细胞生产药物蛋白具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种筛选LO2细胞的方法，以及利用该方法构建LO2细胞池，稳定地表达目的蛋白，缩短实验研发周期。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种筛选LO2细胞的方法，包括以下步骤：在LO2细胞中先后加入具有第一浓度的抗生素和第二浓度的抗生素进行培养；所述第
一浓度的抗生素能够富集细胞，所述第二浓度的抗生素能够筛选细胞。
[0007]专利技术人经大量的实验发现，先后加入不同浓度的抗生素，且第一次加入的抗生素浓度低于第二次加入的抗生素浓度，使得第一次加入的抗生素对细胞产生富集作用，第二次加入的抗生素对细胞进行筛选，避免一次加入的抗生素浓度过高时，由于细胞无法直接耐受高浓度的抗生素而或率下降乃至死亡，或由于一次加入的抗生素浓度过低，使抗生素无法对细胞进行筛选，导致大量的假阳性克隆。
[0008]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述LO2细胞为基因工程改造的LO2细胞。
[0009]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述抗生素为嘌呤霉素。
[0010]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述第一浓度的抗生素和第二浓度的抗生素均采用LO2细胞培养基作为溶剂配制而成。
[0011]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述嘌呤霉素的第一浓度为0.5～3μg/mL，第二浓度为3.5～5μg/mL。
[0012]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述嘌呤霉素的第一浓度为0.5μg/mL，第二浓度为4.5μg/mL。
[0013]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述加入所述第一浓度的抗生素与加入所述第二浓度的抗生素所间隔的时间为20～30小时。
[0014]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述加入所述第一浓度的抗生素与加入所述第二浓度的抗生素所间隔的时间为24小时。
[0015]作为本专利技术所述筛选LO2细胞的方法的优选实施方式，所述加入所述第一浓度的抗生素与加入所述第二浓度的抗生素所间隔的时间包括细胞培养时间。
[0016]嘌呤霉素用于筛选细胞时，处理观察时间通常为3～5天，筛选时间过长或过短都不易于阳性转化株的筛选。本申请专利技术人经过大量的实验发现，采用本方法使用嘌呤霉素筛选LO2细胞，细胞培养时间不超过30小时，缩短了实验时间。
[0017]本专利技术还提供一种LO2细胞池的构建方法，包括以下步骤：
[0018](1)目的基因质粒的获取；
[0019](2)制备慢病毒上清液；
[0020](3)慢病毒上清液去感染LO2细胞，获得基因工程改造的LO2细胞；
[0021](4)采用上述筛选LO2细胞的方法对步骤(3)的LO2细胞进行筛选。
[0022]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种筛选LO2细胞的方法，通过先后两次加入不同浓度的嘌呤霉素对经过基因工程改造的LO2细胞进行筛选，快速的筛选出阳性转化的LO2细胞，避免高浓度抗生素杀死阳性转化株和低浓度抗生素产生大量假阳性，节约了实验时间；本专利技术还提供该筛选LO2细胞的方法在LO2细胞池的构建方法中的应用，本专利技术的筛选LO2细胞的方法使细胞提前进入细胞活率的持续增长期。
附图说明
[0023]图1为第一浓度为0.5μg/mL和第二浓度为4.5μg/mL的嘌呤霉素筛选LO2细胞0h的显微观察图。
[0024]图2为第一浓度为0.5μg/mL和第二浓度为4.5μg/mL的嘌呤霉素筛选LO2细胞12h的
显微观察图。
[0025]图3为第一浓度为0.5μg/mL和第二浓度为4.5μg/mL的嘌呤霉素筛选LO2细胞24h的显微观察图。
[0026]图4为第一浓度为0.5μg/mL和第二浓度为4.5μg/mL的嘌呤霉素筛选LO2细胞48h的显微观察图。
[0027]图5为采用本专利技术LO2细胞池的构建方法构建的LO2细胞池表达的蛋白电泳图。
具体实施方式
[0028]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
[0029]实施例1
[0030]本实施例采用不同抗生素浓度对经过转染的LO2细胞进行筛选。
[0031]试验组1:在经过转染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选LO2细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：在LO2细胞中先后加入具有第一浓度的抗生素和第二浓度的抗生素进行培养；所述第一浓度的抗生素能够富集细胞，所述第二浓度的抗生素能够筛选细胞。2.如权利要求1所述筛选LO2细胞的方法，其特征在于，所述LO2细胞为基因工程改造的LO2细胞。3.如权利要求1所述筛选LO2细胞的方法，其特征在于，所述抗生素为嘌呤霉素。4.如权利要求1所述筛选LO2细胞的方法，其特征在于，所述第一浓度的抗生素和第二浓度的抗生素均采用LO2细胞培养基作为溶剂配制而成。5.如权利要求3所述筛选LO2细胞的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的第一浓度为0.5～3μg/mL，第二浓度为3.5～5μg/mL。6.如权利要求4所述筛选LO2细胞的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的第一浓度为0.5μg/mL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳，顾为望，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：