用于α9/α10烟碱型乙酰胆碱受体的表达系统及其使用方法技术方案

本发明专利技术描述了用于表达α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的表达系统。还描述了使用该表达系统来鉴定α9α10nAChR的激动剂、拮抗剂或变构调节剂的方法。或变构调节剂的方法。或变构调节剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三核酸编码CHAT。CHAT可例如包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0009]在某些实施方案中，重组细胞还包含编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第四核酸：TMIE、TMEM132A、TMEM132C、TMEM132D、TMEM132E、TMEM100和TNFRSF10A。在某些实施方案中，第四核酸编码TMIE。TMIE可例如包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TMEM132A。TMEM132A可例如包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TMEM132C。TMEM132C可例如包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TMEM132D。TMEM132D可例如包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TMEM132E。TMEM132E可例如包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TMEM100。TMEM100可例如包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第四核酸编码TNFRSF10A。TNFRSF10A可例如包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0010]在某些实施方案中，表达系统包括重组细胞，该重组细胞包含(i)编码α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9亚基的第一核酸；(ii)编码α9α10 nAChR的α10亚基的第二核酸；以及(iii)编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第三核酸：胆碱O
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乙酰转移酶(CHAT)、跨膜内耳表达蛋白(TMIE)、跨膜蛋白132A(TMEM132A)、跨膜蛋白132C(TMEM132C)、跨膜蛋白132D(TMEM132D)、跨膜蛋白132E(TMEM132E)、跨膜蛋白100(TMEM100)以及肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)；其中该重组细胞在包含至少一种选自乙酰胆碱(ACh)或甲基牛扁碱(MLA)的化合物的培养基中培养。
[0011]在某些实施方案中，α9α10 nAChR的α9亚基包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，α9α10 nAChR的α10亚基包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三核酸编码TMIE。在某些实施方案中，TMIE包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0012]在某些实施方案中，重组细胞还包含编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第四核酸：CHAT、TMEM132D、TMEM100和TNFRSF10A。在某些实施方案中，CHAT包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，TMEM132A包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，TMEM132C包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，TMEM132D包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，TMEM132E包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，TMEM100包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且TNFRSF10A包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0013]在某些实施方案中，该重组细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可例如选自由以下项组成的组：人胚胎肾293T(HEK293T)细胞、HEK293F细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3细胞、MCF
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7细胞、Hep G2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和Cos7细胞。
[0014]还提供了鉴定α9α10 nAChR的激动剂、拮抗剂或阳性变构调节剂的方法。在某些实施方案中，该方法包括(a)在本专利技术的表达系统的重组细胞生长的条件下培养重组细胞；(b)使该重组细胞与药剂接触；以及(c)确定该药剂是否为α9α10 nAChR的激动剂、拮抗剂或阳性变构调节剂，其中与不与该药剂接触的重组细胞中的α9α10 nAChR的活性相比，激动剂或变构调节剂增加了α9α10 nAChR的活性并且拮抗剂降低了α9α10 nAChR的活性。在某些实施方案中，该药剂是小分子或肽。
[0015]还提供了鉴定能够增强α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)表达的蛋白质的方法。在某些实施方案中，该方法包括(a)培养重组细胞，该重组细胞包含编码α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9亚基的第一核酸和编码α9α10 nAChR的α10亚基的第二核酸；(b)使该重组细胞与蛋白质表达文库接触；以及(c)确定α9α10 nAChR的表达水平，其中与未接触的重组细胞中的α9α10表达相比，α9α10 nAChR表达的增加表明蛋白质增强了α9α10 nAChR的表达。
[0016]还提供了试剂盒，该试剂盒包括(i)本专利技术的表达系统；和(ii)使用说明。
附图说明
[0017]结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述
技术实现思路
和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
[0018]图1显示了来自用单独的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)、α9α10 nAChR和CHAT、α9α10 nAChR和TMIE、或α9α10 nAChR、CHAT和TMIE转染的HEK293T细胞的代表性荧光成像酶标仪(FLIPR)迹线的图。通过用200μm乙酰胆碱(ACh)处理细胞180秒来诱发反应。
[0019]图2A至图2C显示了用不同浓度的ACh处理180秒的HEK293T细胞的FLIPR迹线的图。图2A显示了表明用α9α10 nAChR和CHAT共转染的HEK293T细胞的结果的图。图2B显示了表明用α9α10 nAChR和TMIE共转染的HEK293T细胞的结果的图。图2C显示了表明用α9α10 nAChR、TMIE和CHAT共转染的HEK293T细胞的结果的图。绘制对ACh的最大FLIPR反应。
[0020]图3A至图3C显示了来自HEK293T细胞的FLIPR迹线的图，表明α9α10 nAChR的药理学表征。通过在存在不同浓度的拮抗剂的情况下用200μm ACh处理细胞180秒来诱发反应。图3A显示了表明用α9α10 nAChR和CHAT共转染的HEK293T细胞的结果的图。图3B显示了表明用α9α1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包括重组细胞的表达系统，所述重组细胞包含：(i)编码α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9亚基的第一核酸；(ii)编码α9α10nAChR的α10亚基的第二核酸；以及(iii)编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第三核酸：胆碱O
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乙酰转移酶(CHAT)、跨膜内耳表达蛋白(TMIE)、跨膜蛋白132A(TMEM132A)、跨膜蛋白132C(TMEM132C)、跨膜蛋白132D(TMEM132D)、跨膜蛋白132E(TMEM132E)、跨膜蛋白100(TMEM100)以及肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)。2.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。3.根据权利要求2所述的表达系统，其中所述哺乳动物细胞选自由以下项组成的组：人胚胎肾293T(HEK293T)细胞、HEK293F细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3细胞、MCF
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7细胞、Hep G2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和Cos7细胞。4.根据权利要求1至3中任一项所述的表达系统，其中所述α9α10nAChR的所述α9亚基包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的表达系统，所述α9α10nAChR的所述α10亚基包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统，其中所述第三核酸编码CHAT。7.根据权利要求6所述的表达系统，其中所述CHAT包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的表达系统，其中所述重组细胞还包含编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第四核酸：TMIE、TMEM132A、TMEM132C、TMEM132D、TMEM132E、TMEM100和TNFRSF10A。9.根据权利要求8所述的表达系统，其中所述第四核酸编码TMIE。10.根据权利要求9所述的表达系统，其中所述TMIE包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。11.根据权利要求8所述的表达系统，其中所述TMEM132A包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述TMEM132C包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述TMEM132D包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述TMEM132E包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述TMEM100包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述TNFRSF10A包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。12.一种包括重组细胞的表达系统，所述重组细胞包含：(i)编码α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的α9亚基的第一核酸；(ii)编码α9α10nAChR的α10亚基的第二核酸；以及(iii)编码至少一种选自由以下项组成的组的蛋白质的第三核酸：胆碱O
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乙酰转移酶(CHAT)、跨膜内耳表达蛋白(TMIE)、跨膜蛋白132A(TMEM132A)、跨膜蛋白132C(TMEM132C)、跨膜蛋白132D(TMEM132D)、跨膜蛋白132E(TMEM132E)、跨膜蛋白100(TMEM100)以及肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)；其...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：詹森药业有限公司，
类型：发明
国别省市：