一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法技术

本发明专利技术属于转基因作物鉴定技术领域，本发明专利技术提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。本发明专利技术利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA，以所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，设计引物进行RPA扩增反应，得到的扩增产物纯度较高，特异性良好，灵敏度达到6fg/μL。该鉴定方法相对于市场上普遍使用的PCR技术缩短了反应时间，降低了反应温度，且对操作人员的技术要求较低，更利于进行现场检测，为检验检疫部门提供了新的检验思路。为检验检疫部门提供了新的检验思路。为检验检疫部门提供了新的检验思路。

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法


[0001]本专利技术涉及转基因作物鉴定
，尤其涉及一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。

技术介绍

[0002]随着世界首例转基因玉米Bt176在1996年开始商业化，转基因玉米在全球范围内得到广泛种植，23年来累计种植7.5亿公顷(ISAAA，2019)。目前，在转基因农作物中Bt基因已被广泛应用，该基因编码的蛋白质被昆虫摄入后会导致昆虫很快死亡，但对于人类是无害的。由于其对玉米螟、棉铃虫和粘虫等效果比较明显，所以转Bt基因玉米已成为商业化种植速度最快的转基因作物之一。
[0003]聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，PCR)是分子生物学中研究的主要手段，现被广泛应用于生命科学以及环境科学等领域中。尤其是PCR技术中的荧光定量PCR技术更是成为转基因作物检测的金标准。但是基于PCR技术的一系列检测手段都有一些相同的受限之处，如检测时间长、过程复杂、高额的仪器费用以及对操作技术要求较高等等，都限制了PCR技术无法实施现场快速检测。
[0004]近些年，随着核酸分子检测技术的不断发展，为了符合市场的需求，核酸恒温扩增技术应运而生。重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase enzyme polymerase amplification，RPA)是核酸恒温扩增技术中的一个闪光点，它可以在37～42℃的恒温条件下快速完成在体外扩增目的核酸片段。RPA反应体系中主要依赖三种酶，分别为重组酶、单链结合蛋白和链置换型DNA聚合酶，其中重组酶在常温下即可使DNA双链变性，因此不需要PCR技术中复杂的变温系统。相较于环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediate amplification，LAMP)在整体反应时温度过高、时间较长且需要设计复杂的引物，RPA技术更适合于现场检测。目前，市场上转基因产品越来越丰富，人们在甄选的同时对其安全性的争论也变得尤为激烈。因此，提供一种简单准确、快速便捷且适合于现场检测的检测方法对转基因产物的鉴别有重要意义。

技术实现思路

[0005]为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供了一种简单、快速、便捷、灵敏度高、特异性强且适合于现场检测的基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，包括如下步骤：
[0008](1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；
[0009](2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；
[0010](3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，
则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。
[0011]优选的，步骤(2)中所述RPA扩增反应的体系为：2～3μL的RPA正向引物，2～3μL的RPA反向引物，28～30μL 2
×
Reaction Buffer，9～10μL dNTPs，5～7μL 10
×
Basic E
‑
Mix，2～4μL 20
×
Core Reaction，6～7μL的Mg
2+
和0.5～1.5μL的待鉴定样品的基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为9～11μmol/L，所述dNTPs的浓度为1～2mmol/L，所述Mg
2+
的浓度为250～300mM，所述待鉴定样品的基因组DNA的浓度为55～65ng/μL。
[0012]优选的，步骤(2)中所述RPA扩增反应的温度为35～40℃，所述RPA扩增反应的时间为28～32min。
[0013]优选的，还包括对步骤(2)所得扩增产物进行纯化的步骤，所述纯化是指利用漂洗液WB对扩增产物进行纯化。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0015]本专利技术建立了一种简单、快速的基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。本专利技术利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA，以所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，设计引物进行RPA扩增反应，得到的扩增产物纯度较高，特异性良好，灵敏度达到6fg/μL。该鉴定方法相对于市场上普遍使用的PCR技术缩短了反应时间，降低了反应温度，且对操作人员的技术要求较低，更利于进行现场检测，为检验检疫部门提供了新的检验思路。
附图说明
[0016]图1为不同方法提取玉米基因组DNA的凝胶电泳图(注：M：DL15000bp DNA Marker；1：实施例2中的改进CTAB法；2：SDS法；3：植物基因组DNA快速提取试剂盒法)；
[0017]图2为不同引物扩增的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：R1，F1；2：R2，F2；3：R3，F3；4：R4，F4)；
[0018]图3为不同RPA反应时间的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：20min；2：25min；3：30min；4：35min；5：40min)；
[0019]图4为不同RPA反应温度的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：37℃；2：38℃；3：39℃；4：40℃；5：41℃)；
[0020]图5为RPA反应体系特异性验证凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：转Bt基因玉米；2：转Bar玉米；3：转EPSPS玉米；4：转Badh玉米；5：阴性对照)；
[0021]图6为RPA反应体系灵敏度验证凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：60ng/μL；2：6ng/μL；3：600pg/μL；4：60pg/μL；5：6pg/μL；6：600fg/μL；7：60fg/μL；8：6fg/μL；9：阳性对照；10：阴性对照)。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，包括如下步骤：
[0023](1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；
[0024](2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；
[0025](3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，
则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。
[0026]在本专利技术中，步骤(1)中所述CTAB法优选为改进CTAB法，所述改进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；(2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；(3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。2.根据权利要求1所述的一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述RPA扩增反应的体系为：2～3μL的RPA正向引物，2～3μL的RPA反向引物，28～30μL 2
×
Reaction Buffer，9～10μL dNTPs，5～7μL 10
×
Basic E

【专利技术属性】
技术研发人员：徐亚维，郑雪，刘相国，陈子奇，赵雪，李鹏，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：