一种用于检测ALK基因重排的探针组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测ALK基因重排的探针组及其应用。该探针组由说明书表1中所示的3221个核苷酸序列制备得到。本发明专利技术直接在ALK基因的目标区域，构建与目标区域完全互补的长度为45bp的单链片段作为候选探针，然后将每一条序列进行批量BLAST比对，保证杂交的每一条探针序列的高特异性；同时精确控制目标区域的靶向，突破探针尺寸限制，提高探针的分辨率；在制备的过程中，采用PCR掺入法，保证产物中含有更多的荧光基团。采用上述探针组用于检测ALK基因重排状态，成本较低且在30分钟内即可完成石蜡组织样本的FISH杂交，敏感性高，特异性强且杂交背景干净、信噪比低。信噪比低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测ALK基因重排的探针组及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种用于检测ALK基因重排的探针组及其应用。

技术介绍

[0002]间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因位于2号染色体短臂，属于胰岛素受体超家族，编码ALK蛋白。
[0003]非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80
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85％，是全球男性和女性癌症相关死亡的主要原因。ALK基因重排是NSCLC发展的驱动突变，并已被证实在5
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6％的NSCLC病例中发现。并且，随着研究的深入，在NSCLC中已经发现了超过19种不同的ALK融合伴侣，包括EML4、KIF5B、KLC1和TPR，因此，对ALK基因重排状态的检测具有重要的临床意义。
[0004]荧光原位杂交实验被认为是评估ALK基因状态的金标准，并且是第一个被批准用于检测断裂信号的ALK重排诊断测试，于2015年6月获得美国食品和药物管理局(US FDA)的批准。
[0005]传统的商业化ALK基因FISH检测主要使用BAC(Bacterial Artificial Chromosome)克隆作为探针经过荧光分子标记后进行杂交检测，然而，BAC克隆制备的探针存在一些非重复序列，探针特异性不高，需要使用Cot1
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DNA进行非特异性封闭，且探针片段普遍偏大，长度在200
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500bp之间，杂交效率偏低，杂交时间长。

技术实现思路
r/>[0006]基于此，本专利技术的目的在于提供一种新的用于检测ALK基因重拍的探针组，该探针组由说明书表1所示的3221个核苷酸序列制备得到。
[0007]优选地，该探针组由上述核苷酸序列通过添加标签序列后扩增得到。
[0008]具体地，所述核苷酸序列的5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG；3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA。
[0009]优选地，PCR扩增体系中含有Alexa fluor555
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dUTP和Alexa fluor488
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dUTP标记的dUTP。
[0010]优选地，所述探针组中的探针标记有荧光材料。
[0011]本专利技术的目的之二在于提供上述探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1，以ALK基因的序列为依据，在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基的核苷酸序列，设定探针Tm为50℃，GC含量范围为40～60％，舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列，再经过全基因组hg38 BLAST比对分析后，最终得到了3221个核苷酸序列，具体参见说明书表1所示；
[0013]S2，分别在每条核苷酸序列的5
’
端加上20bp的标签序列、3
’
端加上20bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的特征性引物，其中5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG，3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA；
[0014]S3，合成S2中的特征性引物并设计其扩增引物；
[0015]S4，以特征性引物为模板，采用步骤S3中的扩增引物在含有Alexa fluor555
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dUTP和Alexa fluor488
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dUTP标记的dUTP的反应体系中PCR扩增，将荧光标记掺入PCR产物中并纯化即得。
[0016]具体地，PCR扩增时所用的引物为：Primer
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F:TAATACGACTCACTATAGG，Primer
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R:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。
[0017]本专利技术的目的之三在于提供一种用于检测ALK基因重排的试剂盒，其特征在于，含有上述探针组。
[0018]本专利技术直接在ALK基因的目标区域，构建与目标区域完全互补的长度为45bp的单链片段作为候选探针，然后将每一条序列进行批量LAST比对，保证杂交的每一条探针序列的高特异性；同时精确控制目标区域的靶向，突破探针尺寸限制，提高探针的分辨率；在制备的过程中，采用PCR掺入法，保证产物中含有更多的荧光基团。
[0019]采用上述探针组用于检测ALK基因重排状态，成本较低且在30分钟内即可完成石蜡组织样本的FISH杂交，敏感性高，特异性强且杂交背景干净、信噪比低。
附图说明
[0020]图1为实施例2中正常人外周淋巴细胞滴片荧光原位杂交后荧光显微镜下的照片；
[0021]图2为实施例4中肺癌石蜡组织切片荧光原位杂交后显微镜下的照片；
[0022]图3为对比例1中肺癌石蜡组织切片荧光原位杂交后显微镜下的照片，其中A1和A2为本申请探针组的检测结果，A3和A4为市面上某公司的探针组的检测结果。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0024]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0025]实施例1
[0026]本实施例提供一种用于检测ALK基因重排的探针组的制备方法，具体包括以下步骤：
[0027]S1，以ALK基因的序列为依据，在不含重复序列的100kb区域分别设计含45个碱基的核苷酸序列，设定探针Tm值为50℃，GC含量范围为40～60％，舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列，再经过全基因(hg38)BLAST比对分析后，最终得到共计3221个核苷酸序列，具体如下表1所示；
[0028]S2，分别在每条核苷酸序列的5
’
端加上20bp的标签序列、3
’
端加上20bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的特征性引物，其中5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO:1)，3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA(SEQ ID NO:2)；
[0029]S3，采用高通量芯片合成技术，按照半导体芯片制备步骤S2中的特征性引物并设计该特征性引物的扩增引物；
[0030]S4，以洗脱后的特征性引物为模板，加入Alexa fluor555
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dUTP和Alexa fluor488
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dUTP标记的dUTP进行PCR扩增，将荧光标记材料掺入PCR产物中，得到荧光标记的PCR产物；PCR扩增时的引物为：
[0031]Primer
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F:TAATACGACTCACTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测ALK基因重排的探针组，其特征在于，该探针组由说明书表1中所示的3221个核苷酸序列制备得到。2.根据权利要求1所述的用于检测ALK基因重排的探针组，其特征在于，该探针组由权利要求1所述核苷酸序列通过添加标签序列后扩增得到。3.根据权利要求2所述的用于ALK基因重排的探针组，其特征在于，所述核苷酸序列的5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG；3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA。4.根据权利要求2或3所述的用于检测ALK基因重排的探针组，其特征在于，PCR扩增体系中含有Alexa fluor555
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dUTP和Alexa fluor488
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dUTP标记的dUTP。5.根据权利要求1所述的用于检测ALK基因重排的探针组，其特征在于，所述探针组中的探针标记有荧光材料。6.制备权利要求1～5任一项所述的探针组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，以ALK基因的序列为依据，在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基的核苷酸序列，设定探针Tm为50℃，GC含量范围为40～60％，舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列，再经过全基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝丹平，魏亮，朱燕华，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：