基因沉默的中介体制造技术

本发明专利技术涉及抑制生物系统中基因表达的方法。本发明专利技术的方法包括将tRNA衍生的多核苷酸引入生物系统中。本发明专利技术的tRNA衍生的多核苷酸包含与其表达将被抑制的基因的内含子区互补的序列。序列。序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因沉默的中介体


[0001]本专利技术涉及抑制生物系统中基因表达的方法。本专利技术进一步涉及tRNA衍生的多核苷酸及其作为药物的用途。

技术介绍

[0002]哺乳动物细胞利用源自各种内源性来源的小RNA(sRNA)调节称为RNA干扰(RNAi)途径中的基因表达。这些sRNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)和小干扰RNA(siRNA)，它们可以对细胞质中许多蛋白编码基因的表达进行转录后调控。
[0003]RNAi途径存在于许多真核生物中并由Dicer酶启动，该Dicer酶将长双链RNA(dsRNA)切割成长度为约21个核苷酸的较短双链片段。这些短双链片段被称为siRNA。每个siRNA被解开形成两条单链RNA，其中一条链(向导链)被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。然后向导链与互补的信使RNA(mRNA)配对，并且切割由Argonaute 2(Ago2)(RISC的催化组分)诱导，导致转录后基因沉默。
[0004]miRNA是参与基因表达调控的非编码RNA，尤其是在发育过程中。如上所讨论的，RNAi包括miRNA的基因沉默效应以及由dsRNA触发的基因沉默效应。miRNA，一旦经Drosha加工，则被Dicer结合和切割，以产生可以掺入RISC中的miRNA。然而，与负载siRNA的RISC不同，负载miRNA的RISC扫描mRNA以寻找潜在的互补序列，并与这些mRNA的3
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非翻译区结合，从而阻止翻译。
[0005]围绕RNAi潜在机制的理解取得的进展已在许多领域得到利用，包括研究，例如基因功能研究，以及用于治疗疾病的各种治疗应用。与一种或多种基因活性相关的疾病应该非常适合基于RNAi的疗法，因为针对这些基因的小RNA可以被设计并用作治疗剂。这些可以包括，例如，癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)。RNAi的临床应用已被用于治疗年龄相关的黄斑变性，并且正在一系列治疗领域中开发进一步的治疗方法，包括治疗各种病毒感染，例如HIV。开发可用于治疗疾病的抑制基因表达的方法将是有利的。
[0006]转运RNA(tRNA)是长度为约75
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90个核苷酸的RNA分子，它们作为接头分子携带氨基酸至mRNA的密码子。tRNA通常采用三叶草结构，其包括受体茎，该受体茎结合氨基酸和与mRNA密码子互补的反密码子臂。除了作为接头分子的作用外，tRNA最近还被鉴定为一类具有未表征作用的新型调节性RNA片段的来源。
[0007]本专利技术的目的是提供抑制基因表达的新分子和方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术涉及介导RNA干扰，特别是基因沉默的新方法。RNAi是RNA分子通过中和靶向mRNA分子以抑制基因表达或翻译的生物学过程。因此，还提供了抑制基因表达的方法。我们还提供了介导基因沉默的新型分离的tRNA多核苷酸及其在治疗疾病的方法中的用途。
[0009]本专利技术部分基于专利技术人的研究，其中她已表明在细胞转染tRNA衍生的多核苷酸
(特别是介导基因沉默的tRNA短片段)后特定基因的mRNA水平和随后的蛋白水平降低是可能的。这些tRNA的短片段被称为tsRNA(tRNA衍生的sRNA)。tsRNA不同于tRNA半段和tRNA片段，它们均是tRNA三叶草叶结构的切割产物。然而，如本文所解释的，tsRNA通过交替(alternative)折叠的tRNA(即茎
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环/发夹结构)的Dicer依赖性切割产生。与siRNA不同，tsRNA在细胞核中通过发夹样tRNA的Dicer切割产生。tsRNA靶向细胞核中的基因。因此，本专利技术不涉及通过切割tRNA三叶草叶结构产生的tRNA半段和tRNA片段。
[0010]专利技术人已表明，内切核糖核酸酶Dicer是典型RNAi中的关键参与者，与具有转录活性的tRNA基因缔合，与折叠成非典型二级结构的tRNA结合并将它们加工成tsRNA。此外，这些Dicer依赖性tsRNA具有功能性，并且特异性靶向许多蛋白编码基因的内含子，导致其新生RNA以Argonaute 2(Ago2)依赖性方式降解。这使机制区分于由已知siRNA介导的其他RNA机制。此外，tsRNA在细胞核中起作用，而其他已知的siRNA在细胞质中起作用。靶向基因或长非编码RNA的内含子导致RNA在细胞核中生成后立即降解。本专利技术人已表明，tsRNA并非由成熟的tRNA产生，而是由折叠成交替二级结构的不同tRNA群体产生的，这种结构可以被描述为茎
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环/发夹结构。这些交替折叠的tRNA被Dicer识别并在细胞核中加工成tsRNA。因此，我们提出了Dicer依赖性基因表达调控的新机制，该机制由tsRNA通过新生RNA降解介导，与熟知的转录后或转录基因沉默不同。
[0011]重要的是，本专利技术人已表明tsRNA靶基因与各种疾病(例如癌症)显著相关，这巩固了该途径的生物学重要性。因此，如本文所述的tsRNA可用于治疗疾病。
[0012]本专利技术的专利技术人已经发现，通过将tRNA衍生的多核苷酸(例如tsRNA)引入生物系统(例如细胞)中，可抑制基因或长非编码RNA的表达，前提是该tRNA衍生的多核苷酸包含与该基因的内含子区部分或完全互补的序列。本专利技术人使用该方法实现的基因表达抑制已被证明非常有效。
[0013]不希望受理论束缚，专利技术人的理解是tsRNA通过靶向蛋白编码基因的内含子用于新生RNA降解而不需要转录抑制和异染色质形成来共转录调控细胞核中的基因表达。
具体实施方式
[0014]现将进一步描述本专利技术的实施方案。在以下段落中，描述了不同的实施方案。除非明确指出相反，否则如此定义的每个方面均可以与任何其他方面或多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。
[0015]通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域熟知和常用的那些。本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种常规和更具体的参考文献中所描述的，除非另有说明。参见，例如，Green和Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第4版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，细约(2012)。
[0016]多核苷酸
[0017]在本专利技术的第一方面，提供了一种分离的tRNA衍生的多核苷酸，包含与靶基因的内含子区或长非编码RNA的内含子区互补的序列，特别是其中所述tRNA衍生的多核苷酸是具有14至35个核苷酸的tRNA衍生的多核苷酸片段(tsRNA)。
[0018]术语“分离的”意指tRNA衍生的多核苷酸从其天然环境中分离，而不是天然存在
的。这表明有人工参与。当提及核酸分子时，该术语意指核酸分子或多肽至少基本上不含在自然界中天然相关并且如在自然界中所发现的至少一种其他组分。
[0019]本领域技术人员将理解，术语“多核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的tRNA衍生的多核苷酸，包含与靶基因的内含子区或长非编码RNA的内含子区互补的序列，其中所述tRNA衍生的多核苷酸是具有14至35个核苷酸的tRNA衍生的多核苷酸片段(tsRNA)。2.根据权利要求1所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tsRNA是双链的或单链的。3.根据权利要求2所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中双链tsRNA是平末端的。4.根据权利要求3所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述双链tsRNA包含突出端。5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tRNA衍生的多核苷酸经化学修饰。6.根据权利要求1所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸是tRNA。7.根据权利要求6所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tRNA包含茎
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环/发夹结构。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸结合靶基因的mRNA的内含子区，从而抑制基因表达。9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与所述靶基因的内含子区至少50、60、70、80、90或95％互补的序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述靶基因与病理状况相关。11.根据权利要求10所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述病理状况选自癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、呼吸疾病和心血管疾病。12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tRNA和所述tsRNA位于细胞核中。13.一种载体，包含根据权利要求1至12中任一项所述的分离的tRNA片段。14.一种宿主细胞，包含根据权利要求1至12中任一项所述的分离的tRNA片段或权利要求13的载体。15.一种抑制生物系统中靶基因表达或长非编码RNA表达的方法，所述方法包括：将根据权利要求1至12中任一项所述的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求13的载体引入所述生物系统中。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物系统选自真核细胞，例如哺乳动物细胞或植物细胞。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述方法进一步包括将酶引入所述生物系统中，其切割tRNA以产生tsRNA。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶是Dicer。19.根据前述权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述tRNA衍生的多核苷酸引入细胞的细胞核中。20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将酶引入所述生物系统中，其将所述tRNA衍生的多核苷酸转运至细胞核。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶包含Argonaute2(Ago2)。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法或离体方法。23.一种药物组合物，包含根据权利要求1至12中任一项所述的tRNA衍生的多核苷酸，或载体，例如根据权利要求13所述的载体，或用于已用tsRNA调节的改良细胞疗法的载体，以及药学上可接受的运载体。24.根据权利要求1至12中任一项所述的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求23所述的药物组合物，其用作药物。25.根据权利要求1至12中任一项所述的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗可以通过抑制所述靶基因表达而改善的疾病。26.根据权利要求24或25所述使用的tRNA衍生的多核苷酸或药物组合物，其中所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、呼吸疾病和心血管疾病。27.根据权利要求27所述使用的tRNA衍生的多核苷酸或药物组合物，其中所述疾病选自癌症并且所述tRNA衍生的多核苷酸与第...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫尼卡，
申请(专利权)人：癌症研究科技有限公司，
类型：发明
国别省市：