因子H载体及其用途制造技术

本公开的多个方面涉及用于在细胞或受试者中表达因子H蛋白(或其变体)的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码因子H蛋白变体的转基因和一个或多个调节序列的分离的核酸和rAAV。在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于治疗患有与因子H缺乏相关的疾病的受试者。的疾病的受试者。的疾病的受试者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】因子H载体及其用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求在2019年4月10日提交的标题为“FACTOR H VECTORS AND USES THEREOF”的美国临时申请号62/831,870的申请日的权益，其全部内容通过引用以其全文并入本文。

技术介绍

[0003]因子H(Factor H，FH)是补体激活的旁路途径(alternative pathway，AP)的血浆调节子，其抑制在液相中和在细胞表面上的补体激活。人FH中的单核苷酸多态性和罕见突变与年龄相关性黄斑变性和严重的肾脏疾病有关，包括C3肾小球疾病(C3 glomerulopathy，C3G)和非典型溶血性尿毒综合征(atypical hemolytic uremic syndrome)。

技术实现思路

[0004]本公开的多个方面涉及用于将因子H(FH)递送至细胞(例如，受试者的细胞)的组合物和方法。本公开部分基于分离的核酸(例如，rAAV载体)和经工程化以表达编码因子H蛋白或其变体的转基因的rAAV。在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸和rAAV包含一个或多个以下结构特征：长的鸡β肌动蛋白(Chicken Beta Actin，CBA)启动子、延伸的CBA内含子、Kozak序列、密码子优化的编码人类因子H(human Factor H，hFH)蛋白变体的核酸序列、一个或多个miR
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142结合位点(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个miR
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142结合位点等)和兔β
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球蛋白(rabbit beta
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globulin，RBG)poly A序列。在一些实施方案中，与先前描述的经工程化以表达因子H的AAV构建体(例如，具有如SEQ ID NO:20所示的核酸序列的构建体)相比，本公开描述的分离的核酸和rAAV在细胞或受试者中表达因子H蛋白的水平增加(例如，增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍)。
[0005]因此，在一些方面，本公开提供了一种包含含有与Kozak序列(SEQ ID NO:19)有效连接的编码因子H蛋白变体的核酸序列的转基因的分离的核酸，所述因子H蛋白变体具有与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少70％同一的氨基酸序列。
[0006]在一些实施方案中，因子H蛋白变体包含与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少80％、90％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，因子H蛋白变体由如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。
[0007]在一些实施方案中，编码因子H蛋白变体的核酸序列与如SEQ ID NO:4所示的核酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％同一。
[0008]在一些实施方案中，转基因包含与核酸序列和/或Kozak序列有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:11或12所示的序列。在一些实施方案中，启动子进一步包含增强子序列。在一些实施方案中，增强子序列包含如SEQ ID NO：9或10所示的序列。在一些实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO：9和11所示的序列。在一些实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO：10和12所示的序列。
[0009]在一些实施方案中，转基因包含一个或多个内含子(例如，一个或多个合成的或人工内含子)。在一些实施方案中，转基因的至少一个内含子位于启动子和编码因子H蛋白变体的核酸序列之间。在一些实施方案中，至少一个内含子包含如SEQ ID NO：13
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15中任一项所示的序列。
[0010]在一些实施方案中，转基因包含3'非翻译区(3
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untranslated region，3'UTR)。在一些实施方案中，3'UTR包含如SEQ ID NO:17或18所示的序列。
[0011]在一些实施方案中，转基因进一步包含一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于转基因的3'UTR中。在一些实施方案中，至少一个miRNA结合位点是miR
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122结合位点。在一些实施方案中，至少一个miRNA结合位点是免疫相关miRNA结合位点。在一些实施方案中，免疫相关miRNA是miR
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142。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点包含至少三个如SEQ ID NO:16所示的miR
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142结合位点。
[0012]在一些实施方案中，转基因的侧翼(flanked by)是腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，例如AAV2 ITR。
[0013]在一些实施方案中，本公开提供了一种包含如SEQ ID NO:5
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8中任一项所示的序列的分离的核酸。
[0014]在一些实施方案中，本公开提供了包含本文所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或杆状病毒载体。
[0015]在一些方面，本公开提供了包含本文所述的分离的核酸或载体的组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
[0016]在一些实施方案中，本公开提供了包含本文所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
[0017]在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：(i)本文所述的分离的核酸；和(ii)腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白。
[0018]在一些实施方案中，衣壳蛋白对肌肉组织具有趋向性(tropism)(例如，特异性或优先靶向)。在一些实施方案中，衣壳蛋白对眼组织具有趋向性(例如，特异性或优先靶向)。
[0019]在一些实施方案中，衣壳蛋白的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.hr、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43和前述任一项的变体。
[0020]在一些方面，本公开提供了一种用于增加细胞中因子H表达的方法，所述方法包括将本文所述的分离的核酸、载体、组合物或rAAV递送至细胞。
[0021]在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肌肉细胞或眼细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者中。
[0022]在一些方面，本公开提供了一种治疗与因子H缺乏相关的疾病的方法，所述方法包括向患有与因子H缺乏相关的疾病的受试者施用本文所述的分离的核酸、载体、组合物或rAAV。
[0023]在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者的特征在于CFH基因中的一个或多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的核酸，其包含含有与Kozak序列(SEQ ID NO:19)有效连接的编码因子H蛋白变体的核酸序列的转基因，所述因子H蛋白变体具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少70％同一的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述因子H蛋白变体包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少80％、90％、99％或100％同一的氨基酸序列，任选地，其中所述因子H蛋白变体由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成。3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的核酸，其中编码所述因子H蛋白变体的所述核酸序列与SEQ ID NO:4所示的序列至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％同一。4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因包含与所述核酸序列和/或所述Kozak序列有效连接的启动子。5.如权利要求4所述的分离的核酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:11或12所示的序列。6.如权利要求5所述的分离的核酸，其中所述启动子进一步包含增强子序列，任选地，其中所述增强子序列包含SEQ ID NO:9或10所示的序列。7.如权利要求6所述的分离的核酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9和11所示的序列。8.如权利要求6所述的分离的核酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:10和12所示的序列。9.如权利要求1至9中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因包含一个或多个内含子。10.如权利要求9所述的分离的核酸，其中至少一个内含子位于所述启动子和编码所述因子H蛋白变体的所述核酸序列之间。11.如权利要求9或10所述的分离的核酸，其中至少一个内含子包含SEQ ID NO:13
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15中任一所示的序列。12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因包含3'非翻译区(3'UTR)。13.如权利要求12所述的分离的核酸，其中所述3
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UTR包含SEQ ID NO:17或18所示的序列。14.如权利要求1至13中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因进一步包含一个或多个miRNA结合位点。15.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：高光平，谢军，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：