用于AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法技术

本发明专利技术公开了进行转录依赖性定向进化(TRADE)的方法和使用此类方法选择的新型AAV衣壳。本发明专利技术还提供了新型AAV衣壳突变体。TRADE技术被用于鉴定在静脉施用后介导脑中的神经元转导的新型AAV载体。TRADE在体内的应用导致鉴定出在施用新型AAV衣壳后在脑中可以比AAV9更有效、更特异性地转导神经元的新型AAV衣壳。TRADE技术可用于鉴定靶向各种细胞群的AAV衣壳。AAV衣壳。AAV衣壳。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
关于联邦资助研究的声明
[0001]本专利技术是在美国国立卫生研究院/国立神经疾病和中风研究所授予的批准号NS088399的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。


[0002]本公开内容涉及用于基因递送的病毒载体。更具体地，本公开内容涉及转录依赖性定向进化的方法和通过使用该方法选择的腺相关病毒(“AAV”)载体。

技术介绍

[0003]重组腺相关病毒(“AAV”)载体是最有希望用于体内基因递送的载体之一。由于从人类和非人灵长类动物组织中分离出许多天然存在的新血清型和亚型，因此AAV载体的用途得到了扩展。Gao等人,J Virol 78,6381
‑
6388(2004)和Gao等人,Proc Natl Acad Sci USA 99,11854
‑
11859(2002)。在新鉴定的AAV分离株中，AAV血清型8(AAV8)和AAV血清型9(AAV9)受到关注，因为源自于这两种血清型的AAV载体可以在全身施用后以高效率转导多种器官，包括肝、心脏、骨骼肌和中枢神经系统。Ghosh等人,Mol Ther 15,750
‑
755(2007)；Pacak等人,Circ Res 99,3
‑
9(2006)；Inagaki等人,Mol Ther 14,45
‑
53(2006)；Zhu等人,Circulation 112,2650
‑
2659(2005)；Wang等人,Nat Biotechnol 23,321
‑
328(2005)；Nakai等人,J Virol 79,214
‑
224(2005)；和Foust等人,Nature Biotechnol 23,321
‑
328(2009)。AAV8和AAV9载体的这种强力转导归因于这些细胞类型的强烈趋向性、载体的有效细胞摄取和/或细胞中病毒粒子壳的快速脱壳。Thomas等人,J Virol 78,3110
‑
3122(2004)。此外，具有更好性能的衣壳工程化的AAV载体的出现显著拓展了AAV作为载体工具包的实用性。Asokan等人，Mol Ther 20,699
‑
708(2012)。
[0004]使用AAV介导的基因治疗的概念验证已在许多人类疾病的临床前动物模型中得到证实。I/II期临床研究显示了针对治疗血友病B(Nathwani等人,N Engl J Med 71,1994
‑
2004(2014))、脂蛋白脂肪酶缺乏症(Carpentier等人,J Clin Endocrinol Metab 97，1635
‑
1644(2012))、莱伯氏先天性黑蒙症(Jacobson等人,Arch Ophthalmol 130,9
‑
24(2012)以及Pierce和Bennett,Cold Spring Harb Perspect Med 5,a017285(2015))和其他(Mingozzi和High,Nat Rev Genet 12,341
‑
355(2011)以及Wang等人,Nat Rev Drug Discov 18,358
‑
378(2019)中综述的)的有希望的结果。
[0005]尽管有这种希望，但人体研究也揭示了AAV介导的基因治疗中的意外问题和潜在挑战。Manno等人,Nat Med 12,342
‑
347(2006)。此外，尽管我们对AAV生物学和衣壳表型关系的理解取得了快速进展(Adachi等人,Nat Commun 5,3075,(2014)；Grimm等人,Hum Gene Ther 28,1075
‑
1086,(2017)；和Ogden等人,Science 366,1139
‑
1143,(2019))，对于临床AAV载体，仍有许多我们无法合理设计的期望特性。
[0006]为此，已采用高通量筛选方法来鉴定具有此类期望表型的新型AAV衣壳。特别是，体内AAV文库选择策略的发展产生了能够高效转导先前难驾驭的细胞类型的多种设计的
AAV变体(Kotterman和Schaffer,Nat Rev Genet 15,445
‑
451(2014)以及Grimm等人,Mol Ther 23,1819
‑
1831(2015)中综述的)。
[0007]体内文库选择(第一代)的最早尝试依赖于从解剖组织中回收载体基因组DNA。从理论上讲，这种策略会导致回收有效的AAV变体以及介导载体介导的转基因表达所需的一些步骤但不是所有步骤的AAV变体(图1)。因此，筛选合成的AAV变体的多样化文库可能会导致作为完全无效的基因治疗载体的AAV变体的高背景回收。此外，针对特定细胞类型需要进一步处理，例如荧光激活细胞分选或激光捕获显微切割。尽管如此，已经有一些成功地采用这种技术的报告。Excoffon等人,Proc Natl Acad Sci USA 106,3865
‑
3870(2009)；Grimm等人,J Virol 82,5887
‑
5911(2008)；Lisowski等人,Nature 506,382
‑
386(2014)；和Dalkara等人,Sci Transl Med 5,189ra176(2013)。然而，2016年Deverman等人的一项具有里程碑意义的研究表明通过使用Cre
‑
依赖性选择策略(第二代)可以极大地改进这个过程。Deverman等人,Nat Biotechnol 34,204
‑
209(2016)。Cre
‑
依赖性文库选择利用Cre重组酶作用于双链DNA而不是单链DNA的选择性能力，以倒置包含引物结合序列的载体基因组DNA。该序列的倒置允许方向选择性PCR特异性扩增由AAV变体递送至细胞的病毒DNA，这些病毒DNA能够经历转导后期，在该阶段从单链AAV基因组形成双链DNA。此外，使用Cre驱动线有助于以细胞类型特异性方式选择性表达Cre重组酶，从而允许选择有效转导的新型AAV变体。事实上，使用Cre
‑
依赖性选择使作者能够开发一种AAV9变体AAV
‑
PHP.B，在C57BL/6J小鼠全身施用后，其转导能力是亲代AAV9的40倍。Deverman等人,Nat Biotechnol 34,204
‑
209(2016)。不幸的是，最近变得清楚的是，AAV
‑
PHP.B在小鼠中表现出的增强并没有转化至非人灵长类动物的环境(Matsuzaki等人2018和Hordeaux等人2019)。令人惊讶的是，这种增强甚至没有扩展到所有常用的小鼠品系(Mats本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸，包括：侧翼为ITR序列的细小病毒科基因组，其中，所述细小病毒科基因组包含细小病毒科内含子、细小病毒科cap基因和第一方向上的第一多腺苷酸化信号；在腺病毒辅助功能存在情况下驱动细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第一启动子；相对于所述第一方向是反义的第二方向上的第二启动子和第二多腺苷酸化信号，其中，所述第二多腺苷酸化信号位于引起所述细小病毒科cap基因的反义mRNA转录终止的位置。2.如权利要求1所述的核酸，其中，所述第二启动子是细胞类型特异性启动子。3.如权利要求1所述的核酸，其中，所述第二启动子是遍在启动子。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科基因组是包含AAV内含子和AAV cap基因的AAV基因组。5.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是野生型AAV cap基因。6.如权利要求5所述的核酸，其中，所述AAV cap基因序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其他天然AAV分离株cap基因序列。7.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是工程化的AAV cap基因。8.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是文库的多种AAV cap基因之一。9.包含多个权利要求4所述的核酸的核酸文库，其中，所述核酸包含多个独特的AAV cap基因序列。10.如权利要求9所述的核酸文库，其中，所述核酸文库包含大于约102、103、104、105、106、107或108个独特的AAV cap基因序列。11.如权利要求1
‑
8中任一项所述的核酸，进一步包含所述第二方向上的目的基因。12.如权利要求4
‑
8或11中任一项所述的核酸，其中，所述第二多腺苷酸化信号位于所述AAV内含子内。13.如权利要求4
‑
8或11中任一项所述的核酸，其中，所述第二多腺苷酸化信号被定位为使得所述cap基因在所述第一方向上被正确翻译成全长衣壳蛋白并且所述cap基因被正确转录为包含全长AAV cap基因编码序列的反义mRNA。14.一种用于鉴定具有cap基因序列的AAV载体的方法，所述载体当与具有不同cap基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所述方法包括：通过将权利要求9或10所述的核酸文库引入AAV包装细胞系，从所述包装细胞系中回收第一轮AAV TRADE载体文库，制备第一轮AAV TRADE载体文库；用第一轮AAV TRADE载体文库注射一只或多只动物；回收在所述动物的所述目的组织的细胞中富集的AAV载体的cap基因序列；制备包含富集的AAV载体的回收的cap基因序列的第二轮AAV TRADE核酸文库，并将该文库引入AAV包装细胞系，并从所述包装细胞系中回收第二轮AAV TRADE载体文库；通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAV TRADE载体文库并回收所述动物的所述目的组织的细胞中富集的cap基因序列，进行第二轮富集；和
在所述第一轮富集之后、在所述第二轮富集之后以及在任何后续轮富集之后鉴定富集的AAV cap基因序列。15.一种用于制备AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库的方法，包括：将权利要求4
‑
8或11
‑
13中任一项所述的核酸或权利要求9或10所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库。16.一种用于确定AAV载体的新型cap基因序列的方法，所述载体具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，包括：根据权利要求14所述的方法鉴定AAV载体；回收包含cap基因序列的反义mRNA；和确定新型cap基因序列。17.如权利要求16所述的方法，其中，使用RT
‑
PCR回收所述反义mRNA。18.如权利要求16或17所述的方法，还包括确定cap基因序列的步骤。19.一种包含权利要求4
‑
8或11
‑
13中任一项所述的核酸的AAV载体。20.一种核酸，包括：侧翼为ITR序列的细小病毒科基因组，其中，所述细小病毒科基因组包含细小病毒科内含子、细小病毒科cap基因和第一方向上的第一多腺苷酸化信号；在腺病毒辅助功能存在情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第一启动子；和在没有腺病毒辅助功能情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第二启动子。21.如权利要求20所示的核酸，其中，所述第二启动子是细胞类型特异性启动子。22.如权利要求20所述的核酸，其中，所述第二启动子是遍在启动子。23.如权利要求20
‑
22中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是野生型AAV cap基因。24.如权利要求23所述的核酸，其中，所述AAV cap基因序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其他天然AAV分离株cap基因序列。25.如权利要求20
‑
22中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是工程化的AAV cap基因。26.如权利要求20
‑
25中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是文库的多种AAV cap基因之一。27.一种包含多个权利要求20所述的核酸的核酸文库，其中，所述核酸包含多个独特的细小病毒科cap基因序列。28.如权利要求27所述的核酸文库，其中，所述核酸文库包含大于约102、103、104、105、106、107或108个独特的AAV cap基因序列。29.如权利要求20
‑
26中任一项所述的核酸，还包含目的基因。30.一种用于鉴定具有cap基因序列的AAV载体的方法，所述载体当与具有不同cap基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所述方法包括：
通过将权利要求27或28的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系中回收第一轮AAV TRADE载体文库，制备所述第一轮AAV TRADE载体文库；用所述第一轮AAV TRADE载体文库注射一只或多只动物；回收在所述动物的所述目的组织的细胞中富集的AAV载体的cap基因序列；制备包括回收的富集AAV载体的cap基因序列的第二轮AAV TRADE核酸文库，将该文库引入AAV包装细胞系，并从所述包装细胞系中回收所述第二轮AAV TRADE载体文库；通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAV TRADE载体文库并回收在所述动物的所述目的组织的细胞中富集的cap基因序列，进行第二轮富集；和在第一轮富集之后、在第二轮富集之后以及在任何后续轮富集之后鉴定富集的AAV cap基因序列。31.一种制备AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库的方法，包括：将权利要求23
‑
26或29种任一项所述的核酸或权利要求27或28所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收所述AAV TRADE载体或所述AAV TRADE载体文库。32.一种用于确定AAV载体的新型cap基因序列的方法，所述载体具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，包括：按照权利要求30所述的方法鉴定所述AAV载体；回收包含cap基因序列的有义mRNA；和确定新型cap基因序列。33.如权利要求32所述的方法，其中，使用RT
‑
PCR回收所述有义mRNA。34.如权利要求32或33所述的方法，还包括确定cap基因序列的步骤。35.一种包含权利要求23
‑
26或29中任一项所述的核酸的AAV载体。36.如权利要求1
‑
8或11
‑
13中任一项所述的核酸，还包含第二方向上抑制突变的至少一个mRNA剪接。37.如权利要求36所述的核酸，其中，所述抑制突变的至少一种mRNA剪接包括位于剪接供体和/或剪接受体位点的十个核苷酸内的一个或多个核苷酸的改变。38.如权利要求36或37所述的核酸，其中，所述改变不改变由AAV cap基因编码的氨基酸序列。39.一种AAV cap ORF序列，包含剪接供体位点处的外显子
‑
内含子接头中的一个或多个以下突变：AAV1 VP1 cap ORF 1009
‑
CTTAC(接头)CAGCA
‑
1018*(SEQ ID NO:199)AAV3 VP1 cap ORF 1006
‑
CTTAC(接头)CAGCA
‑
1015*(SEQ ID NO:199)AAV1 VP1 cap ORF 1228
‑
TTTAC(接头)CTTCA
‑
1237(SEQ ID NO:200)AAV3 VP1 cap ORF 1237
‑
TATAC(接头)CTTCG
‑
1246(SEQ ID NO:201)AAV1 VP1 cap ORF 1331
‑
ATTAC(接头)CTGAA
‑
1340(SEQ ID NO:202)AAV1 VP1 cap ORF 1434
‑
GCTAC(接头)CTGGA
‑
1443(SEQ ID NO:203)AAV1 VP1 cap ORF 1502
‑
TTTAC(接头)CTGGA
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：中井弘之，塞缪尔，
申请(专利权)人：俄勒冈健康与科学大学，
类型：发明
国别省市：