AAV介导的基因疗法恢复耳畸蛋白基因制造技术

本发明专利技术人在此报告了在DFNB9小鼠模型(OTOF敲除小鼠)中的首个理论验证：当在小鼠听觉系统已经成熟(P30)之后，将片段化的cDNA通过双AAV载体方法耳蜗递送可以有效且持久地修正这些小鼠中的重度耳聋表型。本发明专利技术因此涉及一种允许在内毛细胞中表达全长耳畸蛋白多肽、或其功能片段的载体系统，其用于治疗患有DFNB9耳聋的患者、或在具有DFNB9突变的患者中预防DFNB9耳聋，其中所述患者是具有发育的和成熟的听觉系统的患者，例如新生儿、幼儿、儿童、青少年或成人。青少年或成人。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AAV介导的基因疗法恢复耳畸蛋白基因

技术介绍

[0001]超过一半的非综合征性重度先天性耳聋病例有遗传原因，大多数(～80％)是常染色体隐性(DFNB)形式(Duman D.&Tekin M，FrontBiosci(Landmark编)17：2213
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2236(2012))。耳聋的基因诊断为耳蜗基因疗法提供必要信息，并且在过去几年中基因测试的准确性和可及性得到快速进展。可以在患者症状出现之前的很多年鉴定综合征耳聋基因中的突变，从而为计划疾病管理争取时间。
[0002]耳聋基因编码的蛋白具有对于耳蜗功能至关重要的大范围分子功能，例如感觉器官发育、毛细胞的静纤毛中的声音转导、维持耳蜗内电位(EP)和高浓度的细胞外钾、以及毛细胞和螺旋神经节神经元(SGN)之间的突触神经传递。耳聋基因产生的主要蛋白包括细胞骨架和分子马达中的离子通道和转运蛋白、间隙连接和紧密连接、蛋白亚基、以及在耳蜗发育中瞬时表达的转录因子。在确定“治疗时间窗”中的主要因素是突变是否会影响早期耳蜗发育以及导致显著的细胞变性，这是在该治疗领域中至关重要的问题。
[0003]虽然假体耳蜗植入物目前用于康复(Kral A&O
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Donoghue GM N Engl J Med 363(15)：1438
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1450(2010))，但因为由通道间电干扰对其施加的频率分辨率的固有限制，听力恢复远非完美，特别是对于在嘈杂环境中语音的感知或对音乐的感知。
[0004]开发生物治疗的主要动机是在没有植入任何假体设备的情况下恢复听力，并且实现远远优于耳蜗植入物目前可实现的声音分辨率质量和单位成本。具体地，已经建议使用局部腺相关病毒(AAV)介导的基因疗法的基因疗法用于治疗人的耳聋形式(Zhang等人，Frontiers in Molecular Neuroscience,第11卷，第221条，2018)。
[0005]使用研究Usher型1C疾病的Ush1c c.216G>A敲入小鼠模型，Pan等人，Nature biotechnology；35(3):264
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272(2017)测试了耳蜗基因疗法是否可用于靶向毛细胞以修正耳聋表型。一种新的合成的AAV(Anc80L65)能够转导>90％的毛细胞。该治疗显示耳蜗中的形态保持，并且当在P0
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P1天(即，小鼠出生当天或之后一天，称为“出生后0日或1日”)注射重组病毒载体时，与未治疗的耳朵相比听觉阈值改善60
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70dB。在P10
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P12(即出生后的十或十二天，在听力出现之前(在该物种中约在P12发生))进行相同注射，没有产生任何治疗效果(Pan等人，Nature biotechnology；35(3):264
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272(2017)。
[0006]Akil等人，Neuron 75：283
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293(2012)使用AAV2/1将囊泡谷氨酸转运蛋白3(Vglut3)cDNA递送到新生(即，出生后1至12天)KO小鼠耳蜗中，以治疗内毛细胞的突触传递的病症。基于听觉脑干反应(ABR)和声惊吓反射的数据，他们证明经注射的耳朵中的听觉功能在2周内恢复。
[0007]这两项研究证明，当在出生后早期阶段(即在小鼠毛细胞成熟之前)注射重组病毒载体时，显著缓解耳蜗中的细胞变性。
[0008]迄今为止，所有评估小鼠内耳疗法的基因疗法研究都得出结论：这些疗法对成年动物无效。因此，人们一致认为，基因疗法在听力保存或恢复中的有效性存在关键时期，并且治疗的机会窗口只存在于处于胚胎中或出生后早期阶段的小鼠中，即在听力出现发生之前(Ahmed等人，JARO 18:649
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670(2017))。
[0009]众所周知，小鼠内耳在出生时在结构和功能上仍不成熟，并且在该动物物种中听力出现发生在出生后第12天(P12)，至出生后约第20天(P20)结束(Shnerson和Willott，J.Comp.Physiol.Psychol.94,36
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40(1980))。然而，在人中听力出现和成熟发生在完全不同的时间。事实上，人的内耳在早在子宫内4.5个月时就能够进行听觉功能，并且在出生时结束(参见图6和Hepper PG&Shahidullah BS，Arch Dis Child71(2):F81
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87(1994))。
[0010]这意味着旨在于听力出现前或耳蜗成熟结束前恢复听觉功能的现有技术实验，当转移到人进行试验时应在子宫中进行(图6)。然而，因为在出生后阶段或儿童期(infancy)(即当听觉系统完全成熟和行使功能时)恢复听力被认为是不可能的，所以迄今为止还没有人接受过毛细胞基因疗法。
[0011]尽管如此，耳蜗基因疗法的最终目标是在可以检测出或诊断出潜在的遗传诱导的耳聋后(即，在其出生后的大多数时间中)，治疗人常见的遗传性耳聋。
[0012]确实不可能开发出涉及在子宫中将治疗递送到耳蜗中的基因疗法操作方案，因为这种外科手术可能会引起许多副作用，其中包括确定性的听力丧失(Zhang等人，Frontiers in Molecular Neuroscience，卷11，第221条，2018)。此外，众所周知，在人中DFNB耳聋通常在新生儿阶段(即，在出生后在0到4个月之间)被诊断出来。
[0013]因此，为可转用于(transposable)人，基因疗法方法应经过测试并在逆转已经建立的影响成熟听觉系统的耳聋表型中有效，例如，当施用于出生后天数>P20的小鼠时(对应于年轻人或成年人)。
[0014]这将是符合人伦理和福利的鉴定治疗时间窗口的唯一方法，因为这些治疗可以施用在听觉系统完善的出生后(post
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natal)、儿童(infant)和成人中。
[0015]专利技术详述
[0016]本专利技术人已经开发可选择的研究，以鉴定有实际机会有效预防或逆转受试者(特别是人)中的听力丧失的治疗，在所述受试者中听觉系统(特别是耳蜗)是成熟的，并且不涉及胚胎基因递送。在这种情况下，他们能够证明在内毛细胞中耳畸蛋白(Otoferlin)的重组表达能够在出生后天数>P20时治疗的模型小鼠中(对应于年轻人或成人)恢复听觉。
[0017]耳畸蛋白在耳蜗的感觉内毛细胞(IHC)中大量表达。耳畸蛋白还在中枢神经系统的其他细胞中表达。它在耳蜗毛细胞突触与传入螺旋神经节神经元的突触囊泡融合的最后步骤中起着关键作用。更准确地说，耳畸蛋白对在听觉带状突触的细胞外泌很重要(Roux等人，Cell 127(2):277
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89,2006)。
[0018]在人类中，影响耳畸蛋白基因(“OTOF基因”)的突变导致在出生后但在语言习得之前发生严重的非综合征双侧听觉丧失。其中一些还会导致本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种允许在内毛细胞中表达全长耳畸蛋白多肽或其功能片段的载体系统，其用于治疗患有DFNB9耳聋的患者、或在具有DFNB9突变的患者中预防DFNB9耳聋，其中所述患者是具有发育的和成熟的听觉系统的人，例如新生儿、幼儿、儿童、青少年或成人。2.根据权利要求1所述用途的载体系统，其中所述耳畸蛋白多肽具有序列SEQ ID NO:1。3.根据权利要求1所述用途的载体系统，其包含至少一种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含编码全长耳畸蛋白多肽或其功能片段的多核苷酸。4.根据权利要求1所述用途的载体系统，其包含至少两种AAV颗粒，它们中的每一种包含含有部分编码序列的多核苷酸，对于一种AAV颗粒，所述部分编码序列编码i)耳畸蛋白多肽或其功能片段的N末端部分，对于另一种AAV颗粒，所述部分编码序列编码ii)耳畸蛋白多肽或其功能片段的C末端部分。5.根据权利要求1所述用途的载体系统，其包含至少两种AAV颗粒，每种所述AAV颗粒包含：a)第一多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每个末端的反向末端重复，以及在所述反向末端重复之间从5'至3
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的合适的启动子、之后是含有耳畸蛋白基因的N末端部分的部分编码序列、以及剪接供体位点，或b)第二多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每个末端的反向末端重复，以及在所述反向末端重复之间的从5'至3
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的剪接受体位点、含有耳畸蛋白基因的C末端部分的部分编码序列，之后任选的聚腺苷酸化序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书二一页序列表六二页附图一八页，
申请(专利权)人：国家健康科学研究所国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：