用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组及其12-plex快速分型检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记12

【技术实现步骤摘要】
用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组及其12
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plex快速分型检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及荧光多重PCR技术和微卫星分型技术，具体为用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组12
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plex快速检测方法。

技术介绍

[0002]微卫星(Short tandem repeat,STR)，是真核动物基因组中的串联重复序列，它是共显性标记，其符合孟德尔遗传规律。其串联的重复序列具有多态性，根据多个微卫星标记的分型结果，可以对个体进行区分从而实现个体识别；根据孟德尔遗传规律对比亲本与子代的个体识别分型信息，即可完成亲子鉴定。
[0003]国际动物遗传学学会(International Society for Animal Genetics,ISAG)共推荐了16个微卫星位点(ILSTS006、BM1824、INRA023、ETH225、ETH3、BM1818、SPS115、TGLA227、HAUT27、ETH10、BM2113、TGLA126、CSRM60、CSRM66、TGLA153、TGLA122)及引物序列用于牛的亲子鉴定。进行常规的牛亲子鉴定检测时，一次PCR反应获得一个位点的产物，试验效率低下、成本高昂。目前，国内缺少使用ISAG推荐位点的牛快速检测体系，用于我国牛个体识别和亲子鉴定工作。

技术实现思路

[0004]针对上述存在的技术问题，本专利技术的目的在于：采用ISAG推荐的16个位点中的12个，应用多重PCR技术，提供一套用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组12
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plex快速检测方法。该方法只需一次PCR反应即可完成ISAG推荐的12个牛微卫星标记的基因分型，本检测方法检测效率高、效果稳定，适于推广应用。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006]本专利技术用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组，由12对微卫星引物序列组成，12对微卫星引物序列及携带的荧光标记为：
[0007]微卫星位点ILSTS006，引物序列F:AACACGGAAGCAATCTAAAC，R:ACCCATGTCTCTGCAAATG；产物范围148
‑
166bp，引物终浓度36nM/L，携带标记为FAM；
[0008]微卫星位点BM1824，引物序列F:TAAACTAAAAGATAGTAGAGCAAGG，R:CTTCCTTGAAATGGTGCG；产物范围182
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194bp，引物终浓度27nM/L，携带标记为FAM；
[0009]微卫星位点INRA023，引物序列F:GTTGCTTTTACCTGGCTAAT，R:ACTTGGCAAATGAGTAGTAAAC；产物范围215
‑
239bp，引物终浓度45nM/L，携带标记为FAM；
[0010]微卫星位点ETH225，引物序列F:TAAATTGTGGGCCCTTGAT，R:CACAAGCACCATAATGCAAA；产物范围286
‑
308bp，引物终浓度34nM/L，携带标记为FAM；
[0011]微卫星位点ETH3，引物序列F:ACTGGAGTGACTTACATTTCC，R:CAAACCATGCCAGCGTG；产物范围370
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398bp，引物终浓度24nM/L，携带标记为FAM；
[0012]微卫星位点BM1818，引物序列F:GGAATGGCTATCACCGAAAC，R:
GCATAGTGCTTTCAAGGTCCA；产物范围425
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449bp，引物终浓度24nM/L，携带标记为FAM；
[0013]微卫星位点SPS115，引物序列F:ACGAGACACCAGCAAAGAT，R:GGCAAAAGACACTAGAGGAAT；产物范围136
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162bp，引物终浓度43nM/L，携带标记为HEX；
[0014]微卫星位点TGLA227，引物序列F:AGTGAACCCCCAAAAATG，R:GCCCAGGAATTCCAAATC；产物范围171
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199bp，引物终浓度49nM/L，携带标记为HEX；
[0015]微卫星位点HAUT27，引物序列F:TTGATTTGCATTTCTCTACTAATAG，R:GCCATCATTATCTTTACTCTGAT；产物范围260
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278bp，引物终浓度38nM/L，携带标记为HEX；
[0016]微卫星位点ETH10，引物序列F:CTCCCCTACTCCATACCAG，R:TGTCCAGCGGGTTCAG；产物范围283
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299bp，引物终浓度58nM/L，携带标记为HEX；
[0017]微卫星位点BM2113，引物序列F:GCCCGTGTTTAGACCTGAT，R:CAAACGCCTAGCATGGTAT；产物范围343
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365bp，引物终浓度27nM/L，携带标记为HEX；
[0018]微卫星位点TGLA126，引物序列F:CTGGGCTTCCTTTCATTG，R:ATCTGGTCTTTGGACTGTTG；产物范围460
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476bp，引物终浓度80nM/L，携带标记为HEX。
[0019]采用所述12对微卫星引物序列进行牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记12
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plex快速检测方法，步骤为：确定牛的12个微卫星点位并将所述12对微卫星引物根据相应荧光标记合成为12对荧光标记引物、PCR扩增得到12条目标微卫星序列及检测结果分析步骤。
[0020]优选地，所述PCR扩增得到12条目标微卫星序列，按照如下步骤进行：
[0021]牛的微卫星12重PCR扩增：使用上述合成12对荧光引物，按照各自确定的引物终浓度，配成引物混合液加入反应体系，反应体系为23ul：引物混合液9.1ul、DNA聚合酶(2
×
EasyTaq PCR SuperMix,全式金生物)12.9ul、待测牛DNA 1ul(1～50ng)；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火温度58℃40秒，72℃延伸45秒，共30个循环；72℃延伸30分钟；4℃保持；通过一次PCR扩增得到12条目标微卫星序列产物。
[0022]优选地，每对引物中至少一条使用荧光标记标记其5
’
端，12对引物分为2组，每组使用不同荧光标记，其中：ILSTS006、BM1824、INRA023、ETH225、ETH3、BM1818为第一组，使用FAM荧光标记；SPS115、TGLA227、HAUT27、ETH10、BM2113、TGLA126为第二组，使用HEX荧光标记。
[0023]优选地，所述检测结果分析步骤，按照如下方法进行：
[0024]使用ABI 3730xl测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于牛个体识别和亲子鉴定的微卫星标记引物组，其特征在于：由12对微卫星引物序列组成，12对微卫星引物序列及携带的荧光标记为：微卫星位点ILSTS006，引物序列F:AACACGGAAGCAATCTAAAC，R:ACCCATGTCTCTGCAAATG；产物范围148
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166bp，引物终浓度36nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点BM1824，引物序列F:TAAACTAAAAGATAGTAGAGCAAGG，R:CTTCCTTGAAATGGTGCG；产物范围182
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194bp，引物终浓度27nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点INRA023，引物序列F:GTTGCTTTTACCTGGCTAAT，R:ACTTGGCAAATGAGTAGTAAAC；产物范围215
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239bp，引物终浓度45nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点ETH225，引物序列F:TAAATTGTGGGCCCTTGAT，R:CACAAGCACCATAATGCAAA；产物范围286
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308bp，引物终浓度34nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点ETH3，引物序列F:ACTGGAGTGACTTACATTTCC，R:CAAACCATGCCAGCGTG；产物范围370
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398bp，引物终浓度24nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点BM1818，引物序列F:GGAATGGCTATCACCGAAAC，R:GCATAGTGCTTTCAAGGTCCA；产物范围425
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449bp，引物终浓度24nM/L，携带标记为FAM；微卫星位点SPS115，引物序列F:ACGAGACACCAGCAAAGAT，R:GGCAAAAGACACTAGAGGAAT；产物范围136
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162bp，引物终浓度43nM/L，携带标记为HEX；微卫星位点TGLA227，引物序列F:AGTGAACCCCCAAAAATG，R:GCCCAGGAATTCCAAATC；产物范围171
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199bp，引物终浓度49nM/L，携带标记为HEX；微卫星位点HAUT27，引物序列F:TTGATTTGCATTTCTCTACTAATAG，R:GCCATCATTATCTTTACTCTGAT；产物范围260
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278bp，引物终浓度38nM/L，携带标记为HEX；微卫星位点ETH10，引物序列F:CTCCCCTACTCCATACCAG，R:TGTCCAGCGGGTTCAG；产物范围283
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299bp，引物终浓度58nM/L，携带标记为HEX；微卫星位点BM2113，引物序列F:GCCCGTGTTTAGACCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树义，王喆，尚嵩洋，王昱彤，张丽君，杨术环，刘全，杜学海，
申请(专利权)人：辽宁省农业发展服务中心，
类型：发明
国别省市：