一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和小孢子提取方法技术

本发明专利技术涉及大白菜游离小孢子培养技术领域，公开了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法。取四倍体大白菜花序由外向内的第三圈花蕾，其花瓣长度和花药长度之比小于等于1/2，该方法得到的花蕾进行游离小孢子的提取，小孢子处于单核靠边期，适宜四倍体大白菜游离小孢子培养，能够为四倍体大白菜游离小孢子再生植株的培育提供技术基础。生植株的培育提供技术基础。生植株的培育提供技术基础。

【技术实现步骤摘要】
一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和小孢子提取方法


[0001]本专利技术涉及大白菜游离小孢子培养
，尤其涉及一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法。

技术介绍

[0002]大白菜游离小孢子培养和植株再生因其影响因素居多，诱导培养促其多数基因型材料出胚或出胚材料提高出胚率，需要特定的培养技术，其中用于游离小孢子培养的花蕾选择标准是其首要的技术之一。十字花科作物的花粉小孢子发育分为四分体时期、单核时期、双核时期和三核时期，并非任何时期的小孢子都适于培养，单核时期又可细分为单核早期、单核中期和单核靠边期；不同阶段的花粉小孢子对外界刺激的敏感程度不同，因而小孢子诱导出胚结果不同。
[0003]不同种植物适宜培养的小孢子所处的发育阶段有所不同。Sato等首次成功地进行大白菜游离小孢子培养所选用的大白菜花蕾的长度为2.0mm～2.5mm，该长度的花蕾中大多数小孢子处于单核靠边期，所以研究认为单核靠边期的小孢子最适合进行游离小孢子培养。筛选提取单核靠边期的小孢子，花蕾选取是关键。传统的花蕾选取方法仅靠显微镜观察选择花蕾，因花蕾大小范围较广，费时费工，提取游离小孢子效率低下。
[0004]小孢子的分离有三种方法，一种是漂浮培养法，即将花药接种于液体培养基上，任其内花粉自由释放，然后离心培养；二是磁搅拌法，即将花药放入盛有一定量培养基或渗透剂的三角瓶中，置于磁力搅拌仪上，低速旋转，使小孢子随搅拌逐渐溢出，直至花药呈透明，离心、培养；三是挤压法，这是最早的花粉分离方式。目前在芸薹属植物中绝大多数研究者采用第三种方法。然而目前国内外多家单位均开展了开展了大白菜游离小孢子(n＝10)培养研究，明确了相关二倍体大白菜游离小孢子的提取培养方法，对四倍体大白菜游离小孢子的提取方法并未有相关报道。

技术实现思路

[0005]由鉴于此，本专利技术提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法，旨在为四倍体大白菜游离小孢子培养选准花蕾提供形态标准、规范的游离小孢子提取方法及技术体系的建立提供依据。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法，取四倍体大白菜花蕾，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，满足以下条件：
[0008][0009]其中，L1为花瓣长度，L为花药长度。
[0010]优选的，所述花蕾取四倍体大白菜花序由外向内的第三圈花蕾。
[0011]优选的，所述四倍体大白菜花蕾的取样时间在上午9点
‑
11点，花蕾外表皮干燥时进行。
[0012]优选的，所述取样在3月下旬至5月上旬大白菜开花期间取样。
[0013]优选的，所述四倍体大白菜花蕾的长度为1.5
‑
2mm。
[0014]本专利技术的另外一个目的在于提供从上述方法得到的花蕾中提取游离小孢子的方法，包括以下步骤：将四倍体大白菜花蕾进行消毒，然后置于B5培养基中，挤压花蕾使小孢子充分游离到B5培养基中，尼龙纱网过滤，得到的小孢子提取液用低速离心机离心，去除上清液，所得沉淀物即为四倍体大白菜游离小孢子。
[0015]优选的，所述消毒液为0.1％的升汞(HgCl2)溶液。
[0016]优选的，所述挤压花蕾B5培养基用量为5
‑
8ml，尼龙过滤网规格为300目。
[0017]优选的，所述过滤液进行离心需采用转速为1000转保持5分钟或1200转保持3分钟，重复B5培养基清洗和离心过程。
[0018]优选的，所述四倍体大白菜游离小孢子需加入NLN培养基制成悬浮液进一步优选加入10ml的NLN培养基。
[0019]进一步的，所述四倍体大白菜游离小孢子悬浮液分装于直径6cm的培养皿中，每皿5ml液体。作为一种实施方式，游离小孢子悬浮于10ml NLN液体培养基中，然后分装于直径6cm的10个培养皿中，每皿1ml悬浮液，每皿添加NLN培养基4ml。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法，通过对四倍体大白菜的花瓣和花药长度与小孢子发育时期对应关系进行研究，能够为四倍体大白菜游离小孢子培养选准花蕾提供形态标准，提高四倍体大白菜游离小孢子花蕾的选取效率。同时本专利技术还对应提供了从上述花蕾中提取游离小孢子的方法，为四倍体大白菜游离小孢子再生植株的培育提供技术基础。
附图说明
[0022]图1：大白菜花蕾的解剖结构图；
[0023]图2：大白菜花蕾的外观形态取样部位图；
[0024]图3：大白菜游离小孢子显微镜形态鉴定；
[0025]图4：大白菜游离小孢子采用不同规格尼龙纱网过滤的效果图。
具体实施方式
[0026]本专利技术以四倍体大白菜资源为试材开展四倍体大白菜游离小孢子(n＝20)培养研究，探索相应的培养技术方法，提供了不同于二倍体大白菜游离小孢子培养的四倍体大白菜游离小孢子培养技术体系。
[0027]本专利技术筛选适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾，包括以下步骤：取四倍体大白菜花蕾，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，从花蕾的解剖结构筛选适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾。图1为花蕾剥去萼片后内部的解剖结构图，L1为花瓣长度，L为花药长度。二倍体最佳蕾为不同于二倍体的是，四倍体取样最佳
蕾为
[0028]四倍体大白菜游离小孢子适宜培养的时期与二倍体相同，均为单核靠边期，但外观形态取样部位完全不同。图2为大白菜花蕾的外观形态取样部位图。二倍体取蕾一般取花序从外向内第二圈蕾，而四倍体则需要取花序从外向内第三圈蕾。结果证明，适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾较二倍体更小，通常长度为1.5
‑
2mm。
[0029]作为一种可选的实施方式，本专利技术的大白菜花蕾在3月下旬
‑
5月上旬大白菜开花期间取样。优选在上午在9点
‑
11点，花蕾外表皮干燥时进行取样。
[0030]本专利技术还提供了一种从花蕾中提取四倍体游离小孢子的方法，采用花蕾挤压后离心提取小孢子，具体的，取适宜数量的花蕾置于培养中，挤压花蕾使小孢子充分游离到培养基中，过滤网过滤，离心，所得沉淀物即为大白菜游离小孢子。四倍体因小孢子体积偏大，因此本专利技术要求采用300目尼龙纱网过滤，这不同于二倍体要求的400目。四倍体游离小孢子提取要求离心机转速为1000～1200转离心3～5分钟，可选的为1000转/5分钟或1200转/3分钟，这也不同于二倍体要求的800转/5分钟。其他步骤，二倍体和四倍体小孢子可采用相同的方式。
[0031]作为一种实施方式，花蕾数量可选30
‑
35枚。所述花蕾采用本专利技术以上方法进行采取。采取后的花蕾进行消毒后可进行游离小孢子的提取。优选将采摘的大白菜花蕾用0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法，其特征在于，取四倍体大白菜花蕾，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，满足以下条件：其中，L1为花瓣长度，L为花药长度。2.根据权利要求1所述的花蕾筛选方法，其特征在于，所述花蕾取四倍体大白菜花序由外向内的第三圈花蕾。3.根据权利要求1所述的花蕾筛选方法，其特征在于，所述四倍体大白菜花蕾的取样时间在上午9点
‑
11点，花蕾外表皮干燥时进行。4.根据权利要求1所述的花蕾筛选方法，其特征在于，所述四倍体大白菜花蕾的长度为1.5
‑
2mm。5.从权利要求1～4任意一项所述方法得到的花蕾中提取游离小孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：将四倍体大白菜花蕾置于培养液中，挤压...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓东，王明秋，孟川，吴芳，王玉海，牟金贵，陈占良，马蕾，
申请(专利权)人：河北省农林科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：