一种多肽毒素THTX-Cl19及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽毒素THTX

【技术实现步骤摘要】
一种多肽毒素THTX
‑
Cl19及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种多肽毒素THTX
‑
Cl19及其应用。

技术介绍

[0002]Matriptase，也称细胞膜丝氨酸蛋白酶1(membrane type
‑
serine protease 1,MT
‑
SP1)，最先在人乳腺癌细胞系中被发现，是目前研究最为广泛的TTSPs之一。Matriptase在正常生理条件下主要表达在各种组织的上皮来源细胞中(如前列腺、小肠、胃、肾脏、结肠、肺和胎盘等)；另外，在免疫系统细胞中也有表达，包括巨噬细胞、单核细胞和肥大细胞。
[0003]细胞膜锚定丝氨酸蛋白酶Matriptase在多种肿瘤组织中过量表达，且参与体内细胞膜和细胞外基质中多种生物大分子底物(如pro
‑
HGF、pro
‑
uPA及PAR
‑
2等)的蛋白水解激活，并通过增强肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移，来促进肿瘤的发生、发展和转移。因此，Matriptase作为肿瘤细胞侵袭和转移发生的关键节点，被认为是一个抗肿瘤治疗的重要靶点，开发一种能够抑制Matriptase的酶促作用并适用于抗肿瘤药物的化合物本领域就有十分重要的意义。
[0004]长霜足蛛(Cyriopagopus longipes)是一种栖息在泰国、老挝和柬埔寨等东南亚国家的大型捕鸟蛛。目前对长霜足蛛毒素研究甚少，其多肽毒素的潜力还有很大的挖掘价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种多肽毒素THTX
‑
Cl19及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
[0007]一种多肽毒素THTX
‑
Cl19，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相对分子量为3559.14Da。
[0008]本专利技术以安全高效的筛选靶向抑制Matriptase的多肽为目标，利用有毒动物毒液资源库，拟筛选出具有Matriptase蛋白酶抑制作用的活性成分。利用PET24a大肠杆菌蛋白表达载体系统对Matriptase丝氨酸蛋白酶结构域MT
‑
SP1区域(596
‑
855aa)进行蛋白原核表达和纯化；并通过参数测定确定重组蛋白MT
‑
SP1相关酶动力学参数：Km＝30.9
±
3.2mM,kcat＝2.9*102
±
4.8s
‑
1以及kcat/Km＝7.8x106
±
1.6*106M
‑1·
s
‑
1。通过MT
‑
SP1催化水解Pefachrome tPA拟肽类小分子底物发生显色反应，从长霜足蛛、五步蛇、中华眼镜蛇、间角蜈蚣、黑粗尾蝎等10余种毒液中筛选出对蛋白酶MT
‑
SP1活性有抑制作用的毒素。粗毒筛选实验发现：长霜足蛛粗毒能够显著抑制MT
‑
SP1对Pefachrome tPA底物的降解作用。
[0009]收集RP
‑
HPLC分离纯化后的样品再次进行上述活性筛选。长霜足蛛毒素活性组分(出峰时间25.6min)对MT
‑
SP1重组蛋白表现出较强的抑制作用，其对MT
‑
SP1降解底物作用的半数抑制浓度IC50为0.165μM，经公式换算该组分对MT
‑
SP1的抑制参数Ki值为0.163μM，MALDI
‑
TOF质谱鉴定其相对分子质量为3553.53Da。使用Edman降解法对该组分进行蛋白N端
序列测定，比对长霜足蛛cDNA文库预测的多肽序列后，确定该组分多肽序列为：ACGHLHDPCKPGPPSTNTCCIGLQCRYGSCLVQV(pI/Mw:7.83/3559.14)。根据国际多肽毒素标准命名规则，将该成分命名为THTX
‑
Cl19。
[0010]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种多肽毒素THTX
‑
Cl19在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述抗肿瘤药物为抗前列腺癌细胞的药物。
[0011]经过大量实验表明：THTX
‑
Cl19能有效抑制PC
‑
3前列腺癌细胞的增殖能力；但不影响DU145细胞系和RWPE
‑
1细胞系的增值能力。抗迁移实验表明：THTX
‑
Cl19明显抑制Transwell小室中的细胞迁移；而不同浓度的THTX
‑
Cl19不影响DU145前列腺癌细胞的Transwell小室迁移；而RWPE
‑
1细胞系中几乎没有细胞迁移的发生。同时，划痕愈合实验表明THTX
‑
Cl19有效减缓PC
‑
3前列腺癌细胞的划痕愈合情况；而THTX
‑
Cl19对DU145细胞系的细胞迁移几乎没有影响。此外，THTX
‑
Cl19显著抑制PC
‑
3前列腺癌细胞的Transwell小室侵袭。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0013]本专利技术的多肽毒素THTX
‑
Cl19，是从长霜足蛛毒素中筛选到的，其在体外能有效抑制MT
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SP1对多种底物的降解作用；并抑制Matriptase高表达的PC
‑
3前列腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力。THTX
‑
Cl19对MT
‑
SP1蛋白酶有较高的选择性，目前仅发现它对胰蛋白酶酶促反应有抑制作用(Ki＝0.371μM)，对其他蛋白酶及电压门控离子通道无明显抑制效果。说明THTX
‑
Cl19能够用于制备抗肿瘤药物，尤其是防治前列腺癌的药物，对Matriptase介导的前列腺癌症具有一定的防治效果。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]图1是PET24a载体原核表达Matriptase丝氨酸蛋白酶结构域MT
‑
SP1区域(596
‑
855aa)纯化前/后(A/B)SDS
‑
Page图(纯度＞90％；c＝0.1mg/mL)；
[0016]图2是蛋白酶活性域MT
‑
SP1的酶动力学活性检测；A、Matriptase催化Pefachrome tPA底物显色反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽毒素THTX
‑
Cl19，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的多肽毒素THTX
‑
Cl19，其特征在于，相对分子量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中华，胡昊良，李凤娇，梁宋平，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：