一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法，该方法用锶离子和细胞松弛素D处理获得孤雌激活胚胎并建立孤雌胚胎干细胞细胞系，进一步分化形成原始生殖细胞样细胞，将所述原始生殖细胞样细胞与小鼠雌性胚胎性腺体细胞聚合移植到联合免疫缺陷型小鼠体内获得卵子；通过该技术可以产生无限多的正常功能性卵子，该技术无论对于临床治疗不孕不育或卵巢早衰，还是科学研究过程中获得足量的高质量卵子均具有重要的意义。获得足量的高质量卵子均具有重要的意义。获得足量的高质量卵子均具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法。

技术介绍

[0002]生殖细胞是生物体内唯一能通过世代遗传来传递生物全能性及遗传物质的细胞，包括从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGC)直到终末分化的成熟生殖细胞，即精子和卵子。随着人类生活方式改变，世界范围内不孕不育患者逐年增多。了解人类生殖细胞，包括卵子及精子，十分重要。但受限于人类卵子数量和取样困难，以及伦理道德约束，严重阻碍对卵子成熟机制研究和临床生殖相关疾病治疗水平的提高。胚胎干细胞(embryonic stemc ells，ESC)是能够进行自我更新并具有分化潜能的可塑性细胞，可以分化成动物体内两百多种细胞以及几十种组织和器官，它们对研究哺乳动物个体发育的基本规律、疾病发生的原理和再生医学的应用都有不可估量的意义。利用胚胎干细胞的多能性，通过体外诱导人类胚胎干细胞(hESCs)成为人类卵子已经成为本研究领域的热点。
[0003]目前，已经有利用多能干细胞分化形成具体正常功能卵子的报道，其利用雌性胚胎干细胞(ESCs)或雌性诱导性多能干细胞(iPSCs)为起始细胞，在重组蛋白和小分子化合物的作用下经过两步分化的方法形成原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)。第一步通过添加FGF2和Activin A将多能干细胞分化为上胚层样细胞(EpiLCs)，进一步通过添加BMP4、LIF、SCF和EGF，并在3D培养条件下将上胚层样细胞(EpiLCs)分化形成原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)。该原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)与小鼠胚胎期E12.5雌性性腺体细胞聚合并移植到联合免疫缺陷型小鼠肾包囊中能够形成具有正常受精能力的卵子。
[0004]然而，该技术在应用上有以下主要缺陷：
[0005]1、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞在人类应用中具有局限性。
[0006]胚胎干细胞(ESCs)的产生必然会破坏正常的胚胎结构，因此具有较强的伦理道德的问题。并且胚胎干细胞不可能产生自同一个体，因此在未来疾病治疗和应用中会有免疫排斥的风险。
[0007]大多数诱导性多能干细胞(iPSCs)的形成过程会通过引入外源基因激活体细胞的内源性基因表达，从而将体细胞重编程为诱导性多能干细胞。而外源性基因的存在具有一定的致瘤性。另外，诱导性多能干细胞在形成过程中会积累基因突变，从而引起基因组的不稳定，因而也不能够被广泛的应用。
[0008]2、多能干细胞分化形成卵子的过程常常会伴随着基因组印记擦除/重建的不完全，从而降低功能性卵子的产生效率。
[0009]人类基因组是2倍体的，一半的基因组来自于母本，另一半的基因组来自于父本。母源和父源基因组除了携带有DNA遗传信息，也会存在由DNA甲基化为主的基因组印记信息。这些基因组印记信息在母源和父源基因组中是不同的，其可以调控正常的基因表达。胚
胎干细胞来源于受精后的胚胎，而诱导性多能干细胞来源于个体体细胞的重编程，因而这些细胞均含有父本的基因组。在形成原始生殖细胞的过程中，父源和母源的基因组印记会被擦除，随后在原始生殖细胞分化形成卵子的过程中重建母源的基因组印记。
[0010]3、在人多能干细胞形成卵子的过程中，形成的人原始生殖细胞样细胞的两条X染色体激活不完全，因而无法充分进入减数分裂过程，从而无法产生具有正常功能的卵子。一般情况下，来自于父源的X染色的活性是要低于来自于母源的染色体的。
[0011]孤雌激活是运用物理和化学方法，在体外刺激处于MⅡ期的卵母细胞，致使其形成原核，发育成胚胎。卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚称为孤雌胚，分离ICM建立胚胎干细胞系称为孤雌胚胎干细胞(Parthenogenetic embryonic stem cells，pESC)系。目前，尚未有利用孤雌胚胎干细胞分化形成具有完全功能的卵子的报道。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的是提供一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法，以解决上述现有技术存在的问题。本专利技术拟利用锶离子结合细胞松弛素D的方法将卵子孤雌激活形成具有良好发育能力的孤雌胚胎干细胞(pESCs)，并进一步分化形成卵子。因孤雌胚胎干细胞(pESCs)能够通过细胞培养的方法在体外无限扩增，因而可以得到无限的细胞来源。进一步通过细胞分化技术可以产生无限多的功能性卵子。该技术无论对于临床治疗不孕不育或卵巢早衰，还是科学研究过程中获得足量的高质量卵子均具有重要的意义。
[0013]更重要的是，该孤雌胚胎干细胞(pESCs)可以来自于患者本身，并且在孤雌激活过程中不会引入外源基因，因而能够避免伦理道德问题的约束并将应用风险降到最低。此外，因为孤雌胚胎干细胞(pESCs)来源于卵子，因而不具有父源的基因组印记，从而在原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)的形成过程中更容易完成印记的擦除，并更容易建立适合于卵子的母源基因组印记。并且孤雌胚胎干细胞(pESCs)来源的原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)具有两条来自于母源的X染色体，因此应该更容易进入减数分裂过程并形成结构和功能正常的卵子。
[0014]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0015]本专利技术提供一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法，包括：用锶离子和细胞松弛素D处理卵子，获得孤雌激活胚胎并建立孤雌胚胎干细胞细胞系，进一步分化形成原始生殖细胞样细胞，将所述原始生殖细胞样细胞与小鼠雌性胚胎性腺体细胞聚合移植到联合免疫缺陷型小鼠体内，获得卵子。
[0016]进一步地，具体包括以下步骤：
[0017](1)孤雌胚胎干细胞系的建立
[0018]采用离体的小鼠MⅡ期卵子，在含有透明质酸酶的HKSOM溶液中消化颗粒细胞，然后在含有HEPES和丙酮酸钠的单纯钾离子优化培养液溶液中清洗，转入孤雌激活培养液中，孤雌激活；
[0019]孤雌激活后的胚胎于平衡后的KSOM中清洗并培养至所述胚胎发育至囊胚；
[0020]将囊胚收集到丝裂霉素C处理的饲养层上，加入建系培养液进行培养，培养至能看到明显的向外生长物产生；
[0021]收集所述向外生长物，于胰蛋白酶中消化后，用干细胞培养液终止消化，接种于丝裂霉素C处理的饲养层上，进行培养和扩增，得到所述孤雌胚胎干细胞系；
[0022](2)原始生殖细胞样细胞的定向分化和分选
[0023]将雌性胚胎干细胞和孤雌胚胎干细胞培养3
‑
5代后，开始诱导；将雌性胚胎干细胞或孤雌胚胎干细胞接种到重组人纤维连接蛋白包被处理的细胞培养板中，使用EpiLC诱导培养液培养；
[0024]诱导完成后，消化细胞并计数后，采用PGCLCs诱导分化培养液进行分化，再采用SSEA1
‑
APC和CD61
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PE直标抗体进行分选，得到原始生殖细胞样细胞；
[0025](3)磁珠分选E12.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用孤雌激活的孤雌胚胎干细胞体外分化形成卵子的方法，其特征在于，包括：用锶离子和细胞松弛素D处理卵子，获得孤雌激活胚胎并建立孤雌胚胎干细胞细胞系，进一步分化形成原始生殖细胞样细胞，将所述原始生殖细胞样细胞与小鼠雌性胚胎性腺体细胞聚合移植到联合免疫缺陷型小鼠体内，获得卵子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)孤雌胚胎干细胞系的建立将离体的小鼠MⅡ期卵子在含有透明质酸酶的HKSOM溶液中消化颗粒细胞，然后在含有HEPES和丙酮酸钠的单纯钾离子优化培养液溶液中清洗，转入孤雌激活培养液中，孤雌激活；孤雌激活后的胚胎于平衡后的KSOM中清洗并培养至所述胚胎发育至囊胚；将囊胚收集到丝裂霉素C处理的饲养层上，加入建系培养液进行培养，培养至能看到明显的向外生长物产生；收集所述向外生长物，于胰蛋白酶中消化后，用干细胞培养液终止消化，接种于丝裂霉素C处理的饲养层上，进行培养和扩增，得到所述孤雌胚胎干细胞系；(2)原始生殖细胞样细胞的定向分化和分选将雌性胚胎干细胞和孤雌胚胎干细胞培养3
‑
5代后，开始诱导；将雌性胚胎干细胞或孤雌胚胎干细胞接种到重组人纤维连接蛋白包被处理的细胞培养板中，使用EpiLC诱导培养液培养；诱导完成后，消化细胞并计数后，采用PGCLCs诱导分化培养液进行分化，再采用SSEA1
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APC和...

【专利技术属性】
技术研发人员：田成磊，曾明，叶孝颖，刘林，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：