一株肺炎克雷伯菌KP21株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一株肺炎克雷伯菌KP21株及其应用。本发明专利技术从得肺炎的驴中分离出一株肺炎克雷伯菌，然后经过培养后获得中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；将其进行小鼠侵染实验，与该株肺炎克雷伯菌对驴造成的肺炎症状一致；同时用其制备该菌的灭活菌苗，对于有效预防当地流行菌株引起的驴肺炎以及加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用均有重要价值。和可能应用均有重要价值。和可能应用均有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
一株肺炎克雷伯菌KP21株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株肺炎克雷伯菌KP21株及其应用。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯氏菌是肠杆菌科克雷氏菌属中非常重要的一类革兰氏阴性杆菌，同时也是人畜共患的病原微生物，在自然界中分布广泛，在人和动物体内主要分布于呼吸道、肠道及泌尿生殖道，是正常机体微生物群的组成部分，但在免疫功能低下等情况下，可成为致病菌引起机会性感染。
[0003]肺炎克雷伯菌属包括肺炎克雷伯肺炎亚种、臭鼻亚种及鼻硬结亚种3 个亚种，其中肺炎克雷伯肺炎亚种分布最为广泛，是引发多种动物及人肺炎、腹泻、泌尿道、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病的病原菌之一。肺炎克雷伯菌可能对养驴业具有潜在威胁，应引起重视。国内关于驴源肺炎克雷伯菌报道较少。
[0004]驴本身对常见的疾病有较强的耐受力，尤其是在传统的散养条件下，由于养殖的数量少而且分散，驴出现传染病的概率低。然而在规模化养驴场，由于群体养殖密度的增加，使驴传染病发病几率增加，驴疫病一旦爆发和流行将会给驴产业造成公共卫生安全危机，同时也将给阿胶、驴肉、驴奶等产业带来严重的食品安全威胁和经济损失，因此，在集约化养殖、流动频繁以及动物产品交易国际化背景下，做好疫病防控十分必要。虽然肺炎克雷伯菌细菌暂时没有对养驴业造成影响，但为了促进养驴业的快速发展，尽快净化本病和控制该菌的发生和流行，预防阻断肺炎克雷伯菌对驴的感染，必须分离当地的驴肺炎克雷伯流行株，加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用，实现对当地导致驴肺炎的有效防治。

技术实现思路

[0005]为了预防及阻断肺炎克雷伯菌对驴的感染，同时为了促进养驴业的快速发展，本专利技术从得肺炎的驴中分离出一株肺炎克雷伯菌，然后经过培养后获得中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；将其进行小鼠侵染实验，与该株肺炎克雷伯菌对驴造成的肺炎症状一致；同时用其制备该菌的灭活菌苗，对于有效预防当地流行菌株引起的驴肺炎以及加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用均有重要价值。
[0006]本专利技术的技术方案如下：一株肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21，所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21的微生物保藏号为CGMCC22865，保藏日期：2021年07月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0007]所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21来源于驴源；在营养琼脂培养基中培养，得到中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；接种至营养肉汤的菌液中，利用革兰氏染色观察，得到革兰氏阴性、较短粗的杆菌。
[0008]所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21的16S rDNA序列如SEQID No.1所示。
[0009]所述的16S rDNA的PCR扩增细菌16S rDNA的通用引物为：F27序列如SEQID No.2所示：5
′‑
AGAGTTGATCCTGGCTCAG
‑3′
；R1492序列如SEQID No.3所示：5
′‑
AAGGAGGTGATCCAACCGCA
‑3′
。
[0010]上述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21在制备灭活菌苗中的应用。
[0011]有益效果本专利技术提供了一株分离自山东地区导致驴肺炎的驴源肺炎克雷伯菌优势流行株。从驴肺炎的病料中仅分离出肺炎克雷伯菌致病菌，为导致驴肺炎的致病源提供准确的依据。在小鼠侵染实验中，表明该株细菌对小鼠的致病能力较强，同时症状与该株肺炎克雷伯菌对驴造成的肺炎症状一致；用其制备该菌的灭活菌苗免疫性好，对于有效预防当地流行菌株引起的驴肺炎以及其他动物肺炎有重要价值。
附图说明
[0012]图1为驴源肺炎克雷伯菌株KP21的革兰氏染色形态；图2为PCR扩增产物 M：Marker；1：分离菌株KP21。
具体实施方式
[0013]以下的实施例便于更好的理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下属实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0014]实施例 11材料与方法1.1病料2021年4月在山东东阿某驴场发生小规模驴肺炎的情况，该小型驴场总计250头驴，肺炎驴69头，病驴出现呼吸急促及呼吸困难，或有嗜睡、食欲减退等，并相继死亡。对30头死驴的尸检结果显示全部出现肺叶充血、水肿，更进一步有肺叶质实如肝，明显肿胀，呈灰白色，大面积出血。采集1例死驹的纵隔淋巴结、心、肺、肾、肝、脾组织样品进行细菌学检测和病毒筛查等试验。
[0015]1.2主要试剂普通琼脂以及普通营养肉汤培养基购自青岛海博生物有限公司；生化鉴定管购自于青岛海博生物有限公司；药敏片购自 Oxoid 公司。
[0016]1.3 菌株的分离培养将1.1中采集的病料组织置于超净工作台中，用接种环取病料组织内部接种至普通琼脂培养基中，置于 37℃温箱培养 24h，观察其菌落形态。挑取显色培养基中单一菌落，接种至营养肉汤培养基，放入 37℃温箱培养24h，将培养物革兰氏染色镜检，观察菌株形态特征、是否纯化。
[0017]1.4生化鉴定将分离纯化的菌株接种于新型微生物微量生化鉴定管，置于37℃温箱培养24h，观察其底部和斜面颜色变化，按照《伯杰细菌鉴定手册》标准判断结果。
[0018]1.5分离菌16SrDNA的PCR测序1.5.1PCR模板的制备挑取该分离株致病菌纯培养单菌落，普通营养肉汤培养基增菌后，用EasyPureBacteriaGenomicDNAKit提取菌液DNA。
[0019]1.5.216SrDNA的PCR扩增细菌16SrDNA的通用引物序列为F27：5
′
－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3
′
，R1492：5
′
－AAGGAGGTGATCCAACCGCA－3
′
；欲扩增片段大小为1500bp左右，上述引物由北京擎科生物科技有限公司合成；反应体系（25μＬ）：2xTaqPCRMasterMix12.5μＬ、ddH2O9μＬ、上下游引物各（10mmol/L）1μＬ、模板1.5μＬ；反应程序为95℃5min，95℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
[0020]1.5.3测序比对分析单一条目的条带PCR产物，送北京擎科生物科技有限公司，序列为SEQIDNo.1所示。将测序结果通过Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在Gen
‑
Bank中进行比对。
[0021]1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21，其特征在于，所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21的微生物保藏号为CGMCC22865，保藏日期：2021年07月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21，其特征在于，所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21来源于驴源；在营养琼脂培养基中培养，得到中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；接种至营养肉汤的菌液中，利用革兰氏染色观察，得到革兰氏阴性、较短粗的杆菌。3.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌株Klebsiella pneumoniae KP21，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱曼玲，张伟，张亮，齐鹏飞，杨少华，孙建全，杨宏军，段春慧，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：