一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在土拉弗朗西斯菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP

【技术实现步骤摘要】
一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及应用


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，特别涉及一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)为革兰氏阴性球杆菌，是土拉菌病(Tularemia)的致病菌，是最具传染性的致病菌之一，目前已经发现有一百种多种动物可感染此菌。土拉弗朗西斯菌对低温具有特殊的耐受力，在0℃以下的水中可存活9个月，在20～25℃水中可存活1～2个月，而且毒力不发生改变，易通过气溶胶传播且毒性强，已被美国CDC列为A类生物恐怖病原体。另外，土拉弗朗西斯菌对于土拉弗朗西斯菌的实验研究来说，菌株的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。菌株的变异也会影响临床医学的诊断方案。因此，开发快速、准确的、可监测变异的土拉弗朗西斯菌检测分析方法对于土拉弗朗西斯菌的科学研究和应用都具有重要意义。
[0003]经典的土拉弗朗西斯菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异的优势。现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。
[0004]因此，开发土拉弗朗西斯菌的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对土拉弗朗西斯菌进行定性的鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点是指在土拉弗朗西斯菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括土拉弗朗西斯菌参考序列上MNP
‑
1～MNP
‑
15的标记位点。
[0008]上述技术方案中，MNP
‑
1～MNP
‑
15的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的
所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
[0009]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括15对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.30所示。
[0010]上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。
[0011]在本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测所述土拉弗朗西斯菌MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0013]在本专利技术的第四方面，提供了所述的土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在土拉弗朗西斯菌的鉴定中的应用。
[0014]在本专利技术的第五方面，提供了所述的土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在检测土拉弗朗西斯菌菌株内部和菌株间遗传变异中的应用。
[0015]在本专利技术的第六方面，提供了所述的土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建土拉弗朗西斯菌数据库中的应用。
[0016]在本专利技术的第七方面，提供了所述的土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在土拉弗朗西斯菌精细分型检测中的应用。
[0017]以上所述的应用中，具体操作步骤为：
[0018]首先是获取待测样本的细菌总DNA；利用本专利技术的试剂盒对所述总DNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于25个；
[0019]对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；
[0020]检测多个菌株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；
[0021]测序结果比对到所述的土拉弗朗西斯菌的参考序列上，获取在所述总DNA的检测序列数目和基因型数据。根据在所述总DNA和所述空白对照获得的土拉弗朗西斯菌测序序列数量和检出MNP位点的数目，对所述总DNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得检出MNP位点数目、覆盖每个所述MNP位点的测序序列数目和所述MNP位点基因型数据。
[0022]当用于土拉弗朗西斯菌鉴定时，以拷贝数已知的土拉弗朗西斯菌核酸标准品或与其他DNA病原体的混合物为检测样本，评估所述试剂盒检测土拉弗朗西斯菌的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测土拉弗朗西斯菌时的质控方案和判定方法。
[0023]当用于土拉弗朗西斯菌遗传变异检测时，包括菌株间和菌株内部的遗传变异检测。菌株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较菌株各自在15个MNP位点的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较菌株在所述15个MNP位点上的主基因型是否存在差异。若待比较菌株在至少一个MNP位点的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较菌株的15个位点分别进行扩增，然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较菌株每个MNP位点的基因型进行比对。如果存在主基因型不一致的MNP位点，则待比较菌株之间存在变异。当检测菌株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测菌株所述的MNP位点是否检出主基因型以外的次
基因型。若待测菌株在至少一个MNP位点存在次基因型，则判定待测菌株内部存在遗传变异。
[0024]当用于构建土拉弗朗西斯菌DNA指纹数据库时，将从样本中鉴定的土拉弗朗西斯菌的所述MNP位点的基因型数据，录入数据库文件，构成土拉弗朗西斯菌的DNA指纹数据库；每次鉴定不同的样本时，通过和所述土拉弗朗西斯菌的DNA指纹数据库比对，鉴定样本中的土拉弗朗西斯菌是否和数据库中的菌株在所述MNP位点存在主基因型(在一个MNP位点具有超过50％测序片段支持的基因型)的差异，在至少1个MNP位点存在主基因型差异的土拉弗朗西斯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种土拉弗朗西斯菌的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在土拉弗朗西斯菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括以AJ749949为参考基因组的MNP
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1～MNP
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15的标记位点。2.一种用于检测权利要求1所述土拉弗朗西斯菌MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括15对引物，所述15对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。3.一种用于检测权利要求1所述土拉弗朗西斯菌MNP标记位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。5.一种权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李论，彭海，周俊飞，高利芬，李甜甜，方治伟，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：