芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法，该方法包括以下步骤：选取种间杂交F1代的适期花蕾，灭菌后剥取花药，培养后将子叶型胚转接至胚萌发培养基中，进行每天12

【技术实现步骤摘要】
芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法


[0001]本专利技术属于植物培养领域，具体涉及芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法。

技术介绍

[0002]芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，属天门冬科天门冬属宿根性多年生草本植物，是全球一种重要的经济作物，质嫩味美，营养丰富，风味独特，被誉为“蔬菜之王”，在国际市场久畅不衰，经济价值高，现为中国加工出口贸易额最大的单一蔬菜品种。它因富含皂甙、黄酮、植物多糖和天门冬氨酸等多种活性成分，具有很好的抗肿瘤、抗氧化和降血压等功效。芦笋种植与加工既具有高效农业的特征，又具有生态与健康产业的属性，已被广泛应用于农业、食品加工、医药保健、动物饲料、生态治理、休闲康养等多个领域，经济效益和生态社会效益也日渐显现。目前，我国芦笋产业发展迅速，种植和销售量均跃居世界首位。长期以来，由于芦笋具有雌雄异株、基因型高度杂合以及多年生等特点，遗传背景比较狭窄，其育种难度很大，选育周期很长。为创新芦笋种质资源，我们把收集来的芦笋近缘野生种意大利野生种与芦笋栽培种进行多年杂交配组，最终获得种间杂交F1代。然而利用团队授权的“一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法”不能得到该种间杂交材料的胚状体再生植株，为了更好的利用该种间杂交F1代，利用其优良性状改良芦笋，很有必要建立该种间杂交材料的快速纯化体系。
[0003]目前国内外均未见芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养方法技术研究的报道。但在天门冬属内，芦笋(Asparagus officinalis L.)研究最为深入，现已建立了较成熟的花药小孢子培养技术体系。此外，芦笋与兴安天门冬等近缘种间杂交后代花药培养也先后取得成功。这些天门冬属种质花药小孢子培养技术研究主要都是基于MS培养基中的不同细胞分裂素和细胞生长素等植物激素的浓度及配比。研究发现，天门冬属种质组培快繁最大障碍是生根困难，不同种激素浓度及配比差异很大，不同芦笋品种、雄株和雌株激素浓度及配比也有区别。实践中发现，芦笋与意大利野生种间杂交F1代组培和花培苗生根相当困难。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在针对现有技术缺陷，提供一种芦笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养诱导获得胚状体再生植株的培养方法，以解决现有技术中的培养条件下芦笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导胚状体及再生植株生长情况较差的技术问题。
[0005]本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中培养条件下芦笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养诱导获得胚状体的再生植株生根困难。
[0006]为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培
养方法，包括以下步骤：
[0008](1)在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，除常规增施磷钾肥外，额外增施钙硼镁肥，所述钙硼镁肥由液钙、液硼、悬浮镁和水按照12mL：15mL：12mL：15kg的比例混合得到；促进花芽分化，至雄株开花初期，选取健壮雄株上的部分花蕾进行保留，其余花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后(未经疏掉花蕾步骤所取的花蕾，培养过程中发现活力差，培养成功率低)，再从该植株上选取适期饱满花蕾，灭菌后剥取花药，接入装有固体培养基和液体培养基的培养皿中，封口；
[0009](2)将培养皿置于4℃的条件下暗培养3
‑
5d，然后再置于26℃的条件下继续暗培养，培养至第15
‑
20d，小孢子从花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
[0010](3)培养至第35
‑
45d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第50
‑
55d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至56
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65d，将子叶型胚转接至胚萌发培养基中，进行每天12
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14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生根培养基生根，最后得到可移栽植株；因本种间杂交后代属难生根型，经多次不同配方反复比较试验，需再转入特定激素浓度的生根培养基诱导生根，最后才更容易获得根系健壮植株；
[0011]因碳源种类、用量及部分激素水平对培养成功关系大，所以经实验反复筛选后确定所述步骤(1)中的所述固体培养基为：碳源为蔗糖和葡萄糖，添加有琼脂作为凝固剂的pH＝5.8的MS培养基；所述液体培养基为pH＝5.8的添加有营养液的MS培养基，所述营养液包括：40g﹒L
‑1的蔗糖，20g﹒L
‑1的葡萄糖，0.5
‑
1.0mg﹒L
‑1的6
‑
苄胺基腺嘌呤6
‑
BA，0.5
‑
1.0mg﹒L
‑1的2,4
‑
二氯苯氧乙酸2,4
‑
D，0.1
‑
1.0mg﹒L
‑1萘乙酸NAA，0.03
‑
0.05mg﹒L
‑1谷胱甘肽L
‑
GLU，200mg﹒L
‑1谷氨酰胺GLU；
[0012]将所述固体培养基和所述液体培养基装入所述培养皿的过程为：
[0013]将所述固体培养基和所述液体培养基灭菌，然后先向培养皿中加入所述固体培养基15mL，待所述固体培养基凝固后，再加入所述液体培养基10mL。
[0014]所述步骤(3)中，特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L
‑1的蔗糖，0.5mg﹒L
‑1吲哚丁酸IBA，0.1mg﹒L
‑1萘乙酸NAA，200mg﹒L
‑1谷氨酰胺GLU，8g﹒L
‑1的琼脂粉。
[0015]优选地，所述固体培养基的灭菌条件为：121℃，1.1MPa，20min。
[0016]优选地，采用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器对所述液体培养基进行灭菌。
[0017]优选地，所述步骤(1)中，选取花蕾灭菌接种至培养皿后需要进行预处理，具体过程为：将花蕾灭菌接种至培养皿后置于4℃的条件下3
‑
5d。
[0018]优选地，所述步骤(1)中采用石蜡膜进行封口。
[0019]本专利技术的有益效果为：本专利技术所制备的胚状体能正常生长、成苗率高，且操作简单、省时高效，从开始培养到获得胚状体一般仅需56
‑
65d时间，显著提高了选择效率，节省了大量人力、物力，为加速芦笋栽培种与意大利野生种间杂交后代稳定、纯化及高效选育芦笋新品种等提供了新途径。
[0020]在营养条件方面，在整个花药小孢子培养过程中，添加谷氨酰胺作为有机氮源和碳源，有效促进了花药小孢子诱导胚状体和胚状体生长分化。本专利技术重点添加使用吲哚丁酸、萘乙酸促进生根。其中吲哚丁酸是内源生长素，具有长效性和专一性的特点，能促进细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，施加磷钾肥和钙硼镁肥，所述钙硼镁肥由液钙、液硼、悬浮镁和水按照12mL：15mL：12mL：15kg的比例混合得到；至雄株开花初期，选取健壮雄株上的部分花蕾进行保留，其余花蕾全部疏掉，待花蕾发育充分之后，再从该植株上选取适期饱满花蕾，灭菌后剥取花药，接入装有固体培养基和液体培养基的培养皿中，封口；(2)将培养皿置于4℃的条件下暗培养3
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5d，然后再置于26℃的条件下继续暗培养，培养至第15
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20d，小孢子从花药开裂处自然释放，进入液体培养基；(3)培养至第35
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45d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第50
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55d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至56
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65d，将子叶型胚转接至胚萌发培养基中，进行每天12
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14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株；所述步骤(1)中的所述固体培养基为：碳源为蔗糖和葡萄糖，添加有琼脂作为凝固剂的pH＝5.8的MS培养基；所述液体培养基为pH＝5.8的添加有营养液的MS培养基，所述营养液包括：40g﹒L
‑1的蔗糖，20g﹒L
‑1的葡萄糖，0.5
‑
1.0mg﹒L
‑1的6
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【专利技术属性】
技术研发人员：汤泳萍，周劲松，张冰冰，叶艳英，尹玉玲，罗绍春，谢启鑫，陈光宇，
申请(专利权)人：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：