一株棘孢木霉6S-2及其在减轻苹果连作障碍中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株棘孢木霉6S

【技术实现步骤摘要】
一株棘孢木霉6S
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2及其在减轻苹果连作障碍中的应用


[0001]本专利技术涉及农业微生物
，具体涉及一株棘孢木霉6S
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2及其在减轻苹果连作障碍中的应用。

技术介绍

[0002]苹果连作障碍(ARD)是一种由多种因素引起的复杂疾病(Mazzola和Manici,2012；Spath等，2015)，普遍认为土壤微生物群落结构失衡是造成ARD的主要原因(Mazzola和Manici,2012；Manici等，2018)。前期研究表明，镰孢菌是引起渤海湾地区ARD的主要病原菌(Wang等，2018)，而实验室最近筛选和鉴定的与ARD相关的专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5对苹果植株具有高致病性。传统的化学熏蒸和农药施用对防治ARD非常有效，但不符合生态发展的理念(Lu等，2020)。
[0003]目前，木霉属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属被广泛用作生物防治剂(Harman等2004；Hu等，2020；Maciag等，2020)，符合“双减”的理念。此外，与根际土壤微生物相比，内生菌可以更有效地定殖在植物体中，以适应环境变化，从而增强对疾病的抵抗力，促进植株的生长(Bogner等，2016)，因此内生真菌也常被用作生物防治剂、植物生长促进剂(Saad等，2019；Poveda等，2021；Poveda，2021a)。例如，从天竺葵等分离出的内生真菌具有丰富的生防次生代谢物(Saad等，2019)。Poveda等(2021)还发现内生菌可以通过增加对养分(氮、磷、钾、锌、铁)的获取、产生植物激素从而促进植物的生长。
[0004]木霉属是农业生产中最传统的有益微生物属，对植物病害显示出强大的生防效果。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)是木霉属中的一种重要真菌，研究表明，用棘孢木霉接种洋葱具有作为合成杀真菌剂替代品的潜力，可用于保护洋葱免受病原菌的侵染(Zapata
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Sarmiento等，2020)。棘孢木霉可以分泌几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶，降解真菌细胞壁，促进真菌寄生，对禾谷镰孢菌菌丝的抑制率高达60％，并能够产生聚酮化合物、烷烃和其他抗真菌次级代谢产物以抑制病原体生长，其颗粒菌肥的施用促进了玉米的生长(Wu等，2017；He等，2019)。棘孢木霉与菌根真菌共同作用可促进植物防御体系，抵抗黑荚果病。虽然棘孢木霉在绿色农业中显示出巨大的发展潜力，但尚未见其对引起ARD专化型镰刀菌生防作用的报道。

技术实现思路

[0005]专利技术人经长期的技术与实践探索，专利技术人从连作果园中经常出现的“抑病土壤”现象入手，从连作果园健康的苹果根中分离得到一株棘孢木霉6S
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2，该菌株是一株内生菌，且对ARD专化型层出镰孢菌MR5和多种病原菌均具有拮抗作用；具有蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和漆酶等活性；分泌铁载体、生长素(IAA)和产生氨气，且具有一定的溶磷能力；发酵萃取液具有抑菌和促生的活性；挥发性物质也具有抑菌能力。孢子液施加到连作苹果园土壤中，可减少植物的氧化损伤，促进苹果砧木生长，减轻苹果连作障碍。
[0006]具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2，该菌株已于2021年10月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.23275。
[0008]所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2，分离自连作苹果园健康果树根系，具有如下特征：
[0009]在PDA固体培养基上生长时，初期菌丝为白色的羊毛状，向边缘扩散，菌落背面无色；中期逐渐变成浅绿色，发育较早的菌丝上开始形成孢子环，逐渐由黄色转变为绿色，气生菌丝更为茂盛，变厚，呈现棉絮状；后期菌落会形成3个白绿相间的同心轮纹，圆环上附着有浓密的分生孢子，菌株整体呈现深绿色，且越接近中心的部位颜色越深，缺少气生菌丝，5天即可长满平板；在查彼得培养基上生长时，初期平板上会形成黄色的疱状突起结构，后期逐渐成熟变绿，最终形成黄绿相间的圆环，有利于孢子的产生与繁殖；在CMD培养基和SNA培养基上生长时，菌丝纤细稀薄，菌落透明，呈现辐射状，3天左右即可覆盖整个培养基，分生孢子呈簇垫状，最终形成暗绿色的疱状圆环，在CMD培养基上疱状更加聚合，紧凑，而在SNA培养基中，疱状结构比较分散，呈现半环状或者片状。
[0010]在60倍普通光学显微镜下观察时，菌丝细长有隔，主枝呈树枝状，细长，分生孢子梗分枝形成次生枝，主轴顶端下面生出的初生分枝常呈对生，与主轴的夹角为近90
°
，随着离顶端距离的增加，初次分枝的长度也增加，每对分枝的长度几乎相等，在接近主轴位置形成的二次分枝最长，二次分枝能够产生第三次分枝，而第三次分枝则不再进一步分枝。分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，瓶梗产生于初次、二次和三次分枝的顶端，瓶梗较短，在瓶梗尖端会急剧收缩变细，弯曲，中间膨大，呈现安瓿瓶形，顶端3个或4个一组轮生，呈旋涡状排列，发育成熟后，会在瓶梗尖端产生分生孢子。分生孢子为绿色的球形或者卵圆形，聚集或者分散排列，壁上有细密的小刺，且会有厚垣孢子产生。
[0011]上述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质也属于本专利技术的保护范围。
[0012]作为优选，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液由如下方法制备而成：
[0013]将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2置于PDA培养基上28℃培养7天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液。
[0014]作为优选，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子粉由如下方法制备而成：
[0015]将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液接种于发酵培养基中，28℃恒温培养10
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14d；发酵结束后风干、粉碎、过筛，得到孢子粉；所述发酵培养基是由麦麸和玉米粉按照体积比4：1混合，加入无菌水，使发酵培养基中无菌水的质量分数为45％。
[0016]在本专利技术的一个具体实施方案中，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子粉的制备方法如下：
[0017]将保存在试管中的6S
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2活化后接种在PDA培养基上生长7天至长出孢子，无菌水冲洗孢子，制成孢子液；后采用浅盘发酵的方法扩繁6S
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2的孢子粉。将400g灭菌培养基(麦本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2，其生物保藏号为：CGMCC NO.23275。2.权利要求1所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质。3.根据权利要求2所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质，其特征在于，所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液由如下方法制备而成：将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2置于PDA培养基上28℃培养7天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液；所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子粉由如下方法制备而成：将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液接种于发酵培养基中，28℃恒温培养10
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14天；发酵结束后风干、粉碎、过筛，得到孢子粉；所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的发酵萃取液由如下方法制备而成：将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2置于PDA培养基上28℃培养7天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液；将孢子悬液加入到PDB培养基中，160r/min，28℃，培养8天，过滤后，12000r/min离心5min，收集上清液；将所收集到的上清液与乙酸乙酯按照体积比1：1的比例进行萃取，收集萃取液并浓缩至干粉状，然后再重新回溶于甲醇溶液中，离心后过滤膜除去杂质，制备得到发酵萃取液。4.权利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2或者权利要求2或3所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)6S
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2的孢子悬液、孢子粉、发酵萃取液和/或挥发性物质在如下(1)
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(4)至少一项中的应用：(1)抑制植物病原菌的生长以及孢子的萌发；(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；(3)防治由植物病原...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹承苗，王海燕，毛志泉，刘鑫，吕毅，陈学森，沈向，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：