用于组织修复的支架的低温冷冻方法技术

一种用于组织修复的支架的低温冷冻方法，用于组织修复的支架与间充质干细胞在24孔培养板中培养；每2天换液，培养7天后，形成结构良好的组织工程结构；将制得的组织工程结构浸没在冷冻保护剂中，并在培养箱中孵育12小时；用于组织修复的支架由没食子酸接枝壳聚糖制成。本发明专利技术的低温冷冻方法，适用于含活细胞的组织工程结构(如：支架)的低温冷冻保存，将细胞的存活率和复苏率维持在较高水平，并能使冷冻的干细胞在复苏后继续保持干性和分化潜能。干细胞在复苏后继续保持干性和分化潜能。干细胞在复苏后继续保持干性和分化潜能。

【技术实现步骤摘要】
用于组织修复的支架的低温冷冻方法


[0001]本专利技术涉及一种保存生物制品的方法，特别涉及一种对用于组织修复的支架进行低温冷冻的方法，保持支架中生物制品(如：细胞)的生物活性。

技术介绍

[0002]组织工程和再生医学被认为是修复受损组织和维持生物功能的一种很有前途的方法。在组织工程和再生医学的治疗方法中，以细胞为基础的治疗方法是最近的热点之一。这些疗法已被关注到可以用来再生受损的组织，并提供许多有益的细胞因子。特别是，在支架中植入干细胞可使干细胞维持干性。在之前的研究中，我们建立了以没食子酸接枝壳聚糖支架和间充质干细胞为基础的组织工程结构。此外，支架制造的难点是将细胞封装到支架中，以制备有活性复合生物材料；然而，采购、生长和封装的过程是非常繁琐和耗时的，难以应用于急性疾病。因此，开发一种有效的冻存保存策略，以维持组织工程结构的生物活性和功能，是现代组织工程和再生医学最重要的研究领域之一。能够保存的完整性组织工程结构不仅可以节省捐助者和接受者时间,而且也有可能建立全球高质量的组织工程结构细胞生物信息库。在准备用于临床应用的工程组织时，低温保存策略有可能实现组织工程结构的现货供应。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的在于提供一种低温冷冻方法，用于组织修复的支架的低温冷冻保存。
[0004]本专利技术的另一个目的在于提供一种低温冷冻方法，用于含有生物活性物质的组织修复的支架的低温冷冻保存。
[0005]一种低温冷冻方法，包括：
[0006]用于组织修复的支架与间充质干细胞(如：2
×
104个细胞)在24孔培养板中培养。每2天换液，培养7天后，形成结构良好的组织工程结构；
[0007]将制得的组织工程结构浸没在冷冻保护剂中，并在培养箱中孵育12小时。
[0008]本专利技术的方法，用于组织修复的支架由没食子酸接枝壳聚糖制成。在与间充质干细胞共培养前，该支架浸泡在70％v/v的乙醇中过夜，然后在紫外线下照射12小时。
[0009]本专利技术的方法，其采用的冷冻保护剂，包括海藻糖衍生物、胎牛血清和DMEM培养基。
[0010]另一种冷冻保护剂，包括25mg/mL～100mg/mL海藻糖衍生物、胎牛血清和DMEM培养基。
[0011]另一种冷冻保护剂，包括25mg/mL～100mg/mL海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和DMEM培养基。
[0012]另一种冷冻保护剂，包括25mg/mL～100mg/mL海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和90％v/v DMEM培养基。
[0013]另一种冷冻保护剂，包括50mg/mL海藻糖衍生物、胎牛血清和DMEM培养基。
[0014]另一种冷冻保护剂，包括50mg/mL海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和DMEM培养基。
[0015]另一种冷冻保护剂，包括50mg/mL海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和90％v/vDMEM培养基。
[0016]本专利技术的方法，海藻糖衍生物包括海藻糖和环氧氯丙烷，海藻糖和环氧氯丙烷共价结合。
[0017]另一种海藻糖衍生物，按重量份，包括：
[0018]4～12海藻糖和3～10环氧氯丙烷，海藻糖和环氧氯丙烷共价结合。
[0019]另一种海藻糖衍生物，按重量份，包括：
[0020]4～12海藻糖和3～10环氧氯丙烷，并按如下方法制得：
[0021]重量份4～12海藻糖和NaOH溶解在去离子水中，在65℃～75℃下反应并搅拌15分钟～45分钟，pH 11～12，得到透明粘稠的液体。然后加入重量份3～10环氧氯丙烷，静置36小时～72小时后，用盐酸调节溶液的pH值至中性(如：pH7
±
0.2)，在去离子水中透析3天～5天，再冷冻干燥得到海藻糖衍生物。
[0022]本专利技术的海藻糖衍生物，能够进入细胞，用于细胞的冷冻保护剂，用量如：但不限于25mg/mL～100mg/mL，对冷冻细胞起到保护作用，提高细胞的存活率和复苏率，能保持干细胞的干性和分化潜能。
[0023]将本专利技术的低温冷冻方法含活细胞的组织工程结构(如：支架)的低温冷冻保存，能将细胞的存活率和复苏率维持在较高水平，并能使冷冻的干细胞在复苏后继续保持干性和分化潜能。
附图说明
[0024]图1为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的存活率；
[0025]图2为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的复苏率；
[0026]图3为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的增殖能力；
[0027]图4为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的集落形成能力；
[0028]图5为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的成脂肪、成骨和成软骨三项分化能力染色和数据统计图。
具体实施方式
[0029]以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。本专利技术实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。
[0030]本专利技术以下实施例采用的含间充质干细胞的组织工程结构按如下方法制得：
[0031]用于组织修复的支架(如：由没食子酸接枝壳聚糖制成)与间充质干细胞在24孔培养板中培养；每2天换液，培养7天后，形成结构良好的组织工程结构；
[0032]将制得的组织工程结构浸没在冷冻保护剂中，并在培养箱中孵育12小时。具体地，如：将没食子酸接枝壳聚糖支架浸泡在70％v/v的乙醇中过夜，然后在紫外线下照射12小
时。之后，将没食子酸接枝壳聚糖支架与间充质干细胞(2
×
104个细胞)在24孔培养板中培养。每2天换液，培养7天后，形成组织工程结构。
[0033]本专利技术没食子酸接枝壳聚糖支架的制备方法如下：
[0034]首先将28mmol没食子酸和2.8mmol EDC溶解在40mL 70％乙醇中，并向溶液中加入2.8mmol NHS。将所得溶液在冰浴中搅拌，然后在1小时后加入分散在110mL 70％乙醇中的1.5g壳聚糖。将溶液在冰浴中进一步搅拌30分钟，最后在室温下搅拌24小时。过滤收集沉淀物，并用乙醇洗涤。用去离子水透析3天以除去可能残留的试剂后，通过真空冷冻干燥获得没食子酸接枝壳聚糖。利用没食子酸接枝壳聚糖在酸性溶液下溶解在碱性条件下不溶的物理性质制备多孔的没食子酸接枝壳聚糖支架。首先将1g没食子酸接枝壳聚糖溶解在50ml的0.1v/v％的冰醋酸中。然后再聚四氟乙烯板每孔加入250μL没食子酸接枝壳聚糖溶液，并在
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20℃的冰箱中保持24小时。然后将样品在冷冻干燥器中冻干。将样品用2w/v％NaOH溶液脱酸4小时，并在冷冻干燥器中冻干。最后获得没食子酸接枝壳聚糖支架。
[0035]组织工程结构中间充质干细胞的存活率的实验方法如下：
[0036]对制得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低温冷冻方法，其特征在于包括：用于组织修复的支架与间充质干细胞在24孔培养板中培养；每2天换液，培养7天后，形成结构良好的组织工程结构；将制得的组织工程结构浸没在冷冻保护剂中，并在培养箱中孵育12小时；所述的用于组织修复的支架由没食子酸接枝壳聚糖制成。2.根据权利要求1所述的低温冷冻方法，其特征在于所述的用于组织修复的支架在与间充质干细胞共培养前，该支架浸泡在70％v/v的乙醇中过夜，然后在紫外线下照射12小时。3.根据权利要求1所述的低温冷冻方法，其特征在于所述的冷冻保护剂包括海藻糖衍生物，所述的海藻糖衍生物包括海藻糖和环氧氯丙烷，所述的海藻糖和所述的环氧氯丙烷共价结合。4.根据权利要求3所述的低温冷冻方法，其特征在于所述的海藻糖衍生物用量为25mg/mL～100mg/mL。5.根据权利要求3所述的低温冷冻方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：章毅，蔡海波，王进，伍婷，陈亮，
申请(专利权)人：中国干细胞集团上海生物科技有限公司重庆市干细胞技术有限公司中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司上海市干细胞技术有限公司陕西省干细胞技术有限公司苏州市干细胞技术有限公司三亚市干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：