一种剑麻防御素基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种剑麻防御素基因及其应用，该剑麻防御素基因的核苷酸序列如序列表中SEQ No.1所示，该剑麻防御素基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ No.2所示；本发明专利技术中的剑麻防御素基因所编码的蛋白可抑制烟草疫霉生长，在剑麻斑马纹病等由烟草疫霉引起的真菌病害防控方面具有实用价值。害防控方面具有实用价值。害防控方面具有实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种剑麻防御素基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种剑麻防御素基因及其应用。

技术介绍

[0002]剑麻是一种在热带亚热带地区栽培的重要硬质纤维作物，广泛应用于渔业、航海、航天、工矿、运输、油田等行业，以及用于编织和制作剑麻地毯、剑麻布、过滤器、工艺品等。其在生长过程中常受到病虫害的威胁，主要有剑麻斑马纹病、紫色卷叶病、茎腐病、红蜘蛛、新菠萝灰粉蚧等，导致剑麻纤维减产，对剑麻产业影响较大。化学防治目前仍是剑麻病虫害防治的主要手段，但其对环境生态影响较大，因此，探索绿色高效的病虫害防治技术对剑麻产业可持续发展至关重要。
[0003]植物防御素是一类分子量小、呈碱性、富含半胱胺酸、具有复杂三维折叠结构的短肽，是植物自身为了抵御微生物的入侵而产生的。植物防御素是植物先天免疫系统的重要组成部分，主要作用于病原微生物的细胞膜，微摩浓度下的植物防御素就能够表现出广泛的抑菌活性。因而，它能够抑制一系列植物病原菌的生长，尤其是对丝状真菌具有强烈的活性作用，但对人、畜、植物细胞无害。甘蓝型油菜番茄防御素基因均被证实具有抑菌作用。专利号CN101965131A的《抗真菌的方法》，公开了植物防御素在抗真菌方面的应用。由于植物防御素的抑菌广谱性和高效性等优良特点，有望成为新型的抗菌药物和抗肿瘤药物，在农业生产和人类健康领域应用潜力巨大。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提出一种剑麻防御素基因及其应用。
[0005]本专利技术所述一种剑麻防御素基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位至第204位所示。
[0006]进一步的，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位至第67位所示。
[0007]进一步的，所述蛋白的制备方法为将SEQ No.1序列导入原核表达载体中，获得重组质粒，再将重组质粒导入宿主细胞中，通过原核表达获得氨基酸序列如SEQ No.2所示的蛋白。
[0008]进一步的，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0009]进一步的，所述剑麻防御素基因编码的蛋白在制备抗真菌类产品中的应用。
[0010]进一步的，所述真菌为烟草疫霉。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0012]本专利技术涉及的剑麻防御素基因及蛋白质序列与已公布的剑麻防御素PDF1基因(NCBI序列号：MF175373)存在明显差异，剑麻防御素基因的核苷酸序列长度为204bp，氨基酸序列长度为67，均短于PDF1。
[0013]本专利技术获得的剑麻防御素具有良好的抗菌生物活性，可抑制烟草疫霉生长，可用
于制备抗菌类产品，在剑麻斑马纹病等作物疫霉病害防控方面具有实用价值。
附图说明
[0014]图1为本专利技术剑麻防御素原核表达载体琼脂糖凝胶电泳验证结果；
[0015]图2为本专利技术剑麻防御素蛋白对烟草疫霉抑制效果，图中左侧培养基为平衡缓冲液中不含剑麻防御素蛋白的空白对照，右侧为本专利技术剑麻防御素蛋白对烟草疫霉的抑制效果；
具体实施方式
[0016]为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。
[0017]实施例1
‑
剑麻防御素基因的获得
[0018]①
将已公布的剑麻防御素基因PDF1(NCBI序列号：MF175373)作为参考序列，在剑麻转录组数据库(SRAaccession：PRJNA432160)中进行Blast比对，得到如SEQ No.1所示DNA片段。
[0019]②
以SEQ No.1所示DNA片段为模板设计引物，通过PCR扩增其基因组序列以验证转录组测序结果的准确性，引物序列如下：
[0020]正向引物：5
’‑
ATGACTGTGTTTATTTCTTGT
‑3’
；
[0021]反向引物：5
’‑
TCAACAAGGTCTAGTGCAGAA
‑3’
；
[0022]20μl反应体系包括：10μl PCR SuperMix(全式金，中国)、10pmol正向反向特异引物各1μl、剑麻DNA 1μl、7μl ddH2O。
[0023]反应程序为：95℃变性5min，“95℃15s、60℃15s、72℃15s”循环扩增30次，72℃2min。
[0024]③
PCR产物由北京擎科生物科技有限公司进行Sanger测序，测序结果与SEQ No.1所示序列一致。
[0025]④
采用刺伤接种法接种剑麻斑马纹病病原烟草疫霉，对照处理仅刺伤不接种病原，接种5d后取样。通过天根植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技,中国北京)提取样品RNA，并通过GoScript Reverse Transcription System(Promega,美国)将其反转录为cDNA。通过QuantStudio 6实时荧光定量PCR系统(赛默飞,美国)对剑麻防御素基因进行实时定量PCR验证，引物序列与
②
中相同。
[0026]扩增体系为20μL,其中包括0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、1μL cDNA模板、10μL TransStart Tip Green qPCR Supermix(全式金,中国)、0.4μL Passive Ref
‑
erence Dye(全式金,中国)和7.6μL ddH2O。
[0027]反应程序为94℃30s；94℃3min,94℃10s,58℃30s,共40个循环；溶解曲线循环。
[0028]以剑麻PP2A基因(protein phosphatase 2A)为内参基因,每个样品重复3次作为技术重复,结果用2
‑
ΔΔCt法进行相对定量分析，结果显示剑麻防御素基因在烟草疫霉侵染后显著上调，表明其参与了剑麻抗病应答。
[0029]实施例2
‑
剑麻防御素基因的克隆和表达
[0030]①
由北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成，并将其导入并将其导入
E1 Expression Vector原核表达载体。
[0031]②
采用热激法将原核表达载体导入BL21(DE3)Chemically Competent Cell感受态细胞，在LB固体培养基平板孵育12小时后挑取单克隆用于PCR检测及LB液体培养基培养。
[0032]③
以SEQ No.1所示DNA片段为模板设计引物，通过PCR检测其是否插入到原核表达载体，引物序列与实施例1中相同。
[0033]20μl反应体系包括：10μlPCR SuperMix(全式金，中国)、10pmol正向反向特异引物各1μl、含原核表达载体的菌液1μl、7μl ddH2O。
[0034]反应程序为：95℃变性5min，“95℃15s、60℃15s、72℃15s”循环扩增3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种剑麻防御素基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位至第204位所示。2.如权利要求1所述的剑麻防御素基因，其特征在于，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位至第67位所示。3.如权利要求2所述的剑麻防御素基因，其特征在于，所述蛋白的制备方法为将SEQ No.1序列导入原核表达载体中，获得重组质粒，再将重组质粒导...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兴，谭施北，梁艳琼，易克贤，习金根，吴伟怀，贺春萍，陈河龙，陆英，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：