一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用，其包括如下步骤：构建表达载体、插入信号肽、插入启动子、更换表达载体中的信号肽、更换表达载体中的启动子、挑选高表达菌株、获得双启动子菌株。本发明专利技术的甲酯诱导工艺简单、安全且产量高，降低了脂肪酶的生产成本，具有良好的工业化应用前景。具有良好的工业化应用前景。具有良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用。

技术介绍

[0002]生物柴油是一种可代替石化柴油的可再生绿色能源，具有良好的燃烧特性，较高的安全性和发动机低温启动性能，受到广泛关注。酶法制备生物柴油具有条件温和、对原料要求低、产物易分离和环境友好等特点，是最具发展前景的生物柴油制备方法之一。
[0003]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)也称酰基甘油水解酶，可催化水解、酯化、转酯化、醇解、氨解等多种反应，被广泛应用于食品、洗涤剂、医药、日用品、造纸、生物柴油等行业。但脂肪酶出发菌株的低产量以及高生产成本限制了其工业化应用。
[0004]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统具有遗传稳定、表达水平高、蛋白分离简单、发酵工艺成熟等优点，是目前最常用的异源表达体系之一。异源蛋白表达的影响因素包括宿主的选择、基因密码子的偏好性、基因拷贝数、启动子的转录效率、信号肽的转运效率、培养条件等。如何提高宿主分泌异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：构建表达载体：根据野生型基因优化目的基因，合成后插入到载体中，获得表达载体1；插入信号肽：优化编码信号肽的基因，合成后插入到载体中，获得载体2；插入启动子：优化启动子，优化后的启动子合成后插入到载体上，获得载体3；更换表达载体中的信号肽：将表达载体1和载体2进行双酶切，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体4；更换表达载体中的启动子：将表达载体4和载体3进行双酶切，，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体5；挑选高表达菌株：将表达载体4进行线性化后转化毕赤酵母KM71H，通过高Zeocin抗性浓度筛选得到4拷贝的毕赤酵母基因工程菌K/T0111；获得双启动子菌株：使用线性化后的表达载体5二次转化K/T0111，获得含有双启动子的毕赤酵母基因工程菌K/T0717。2.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体中，目的基因为TLL脂肪酶的基因protll，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体中，使用的载体为载体pPICZαA。4.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，许蕊，李迅，王旭，蔡雨桐，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：