一种基于核酸介导的酶级联用于肌氨酸的检测方法技术

本发明专利技术属于化学检测领域，涉及一种基于核酸介导的酶级联用于肌氨酸的检测方法及试剂盒。该方法包括：通过核酸调控肌氨酸氧化酶(SOX)和过氧化物氧化酶(HRP)之间的间距，以将酶级联反应限定在纳米级的特定区域；显色反应，并测定肌氨酸含量。该方法中核酸分子实现间距的精确调控和高特异性。该方法特异性强，效率高，显著提高检测的灵敏度和精确度，所需要的检测设备和场地苛刻度不高，成本低，具有重要的研究意义和应用价值。重要的研究意义和应用价值。重要的研究意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸介导的酶级联用于肌氨酸的检测方法


[0001]本专利技术属于化学检测领域，涉及一种基于核酸介导的酶级联用于肌氨酸的检测方法及试剂盒，更具体地，是一种测定前列腺癌特异性靶标肌氨酸的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]前列腺癌作为男性发病率第二大高的癌症，越来越受到人们的关注。而当前检测前列腺癌的技术主要是通过检测前列腺癌特异性抗原(PSA)，但是PSA检测存在灰度区间2ng/ml
‑
10ng/ml，当PSA含量处于此区间时，其检测准确度不高，这不利于前列腺癌的早期诊断。PSA检测灵敏度、精准度均有待提高。
[0003]2009年，Sreekumar等人提出肌氨酸与前列腺癌发展有非常密切的相关性，肌氨酸的含量与疾病的发展具有密切的相关性。传统的肌氨酸测定的方法包括：电化学方法(中国专利CN106596693A，专利技术名称：一种用于肌氨酸的电化学检测方法)；紫外光谱法：(中国专利CN110702670A，专利技术名称：一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法)；电泳法：(中国专利CN101718746A，专利技术名称：一种肌氨酸的检测方法)；色谱质谱法(文献：A reproducible and high
‑
throughput HPLC/MS method to separate sarcosine fromα
‑
andβ
‑
alanine and to quantify sarcosine in human serum and urine.Anal.Chem.2011,83,14,5735
–
5740)。但是，这些检测技术中，大多检测仪器昂贵，需专业人员操作，不适合开发低成本的便携式检测装置。因此，研发一种高灵敏、低成本且快速的检测方法一直是本领域技术人员的需要。
[0004]再者，由于肌氨酸是氨基酸小分子，在肌氨酸小分子的特异性和灵敏分析中存在困难。通过高效液相质谱技术检测肌氨酸小分子存在无法有效识别、区别肌氨酸与其他代谢小分子的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术旨在提供一种操作难度低、成本低、高效且特异性强、灵敏度高的肌氨酸检测方法。
[0006]本专利技术一个目的在于提供一种基于核酸介导的酶级联反应的肌氨酸的检测方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1：通过核酸调控肌氨酸氧化酶SOX和过氧化物氧化酶HRP之间的间距，以将酶级联反应限定在纳米级的特定区域；
[0008]步骤2：显色反应，并测定肌氨酸含量。
[0009]具体地，所述步骤1包括：
[0010]向SOX酶溶液中加入交联剂，孵育，测定其SOX的浓度；加入第一核酸，孵育使所述第一核酸连接SOX酶分子，获得连接第一核酸的SOX酶分子；其中所述连接第一核酸的SOX酶中每个SOX酶分子连接至少1条第一核酸链；
[0011]向HRP酶溶液中加入交联剂，孵育，测定其HRP酶的浓度；加入第二核酸，孵育使所
述第二核酸连接HRP酶分子，获得连接第二核酸的HRP酶分子；其中所述连接第二核酸的SOX酶中每个SOX酶分子连接至少1条第二核酸链。
[0012]进一步地，所述步骤1还包括：通过第三核酸连接所述连接第一核酸的SOX酶和所述连接第二核酸的HRP酶。其中，所述第三核酸的序列不同于所述第一核酸序列。
[0013]进一步地，所述第一核酸和第二核酸是脱氧核糖核酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。所述第一核酸、第二核酸和第三核酸是寡核苷酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。优选地，所述第一核酸和第二核酸是脱氧核糖核酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。
[0014]进一步地，所述第一核酸与所述SOX酶的摩尔比为至少5:1，且所述第二核酸与所述HRP酶的摩尔比为至少5:1。优选地，所述第一核酸与所述SOX酶的摩尔比为至少10:1。
[0015]优选地，第一核酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述第二核酸的序列是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。优选地，所述三核酸的序列是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0016]SEQ ID NO.1(5
’‑3’
):TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
[0017]SEQ ID NO.2(5
’‑3’
):TTGGTGGTGGTGGTGGTGGT
[0018]SEQ ID NO.3(5
’‑3’
):
[0019]ACCACCACCACCACCACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[0020]本专利技术的另一个目的在于还提供了一种用于检测肌氨酸的试剂盒，所述试剂盒至少包括：
[0021]肌氨酸氧化酶SOX溶液和过氧化物氧化酶HRP溶液，用于连接和稀释肌氨酸氧化酶和过氧化物氧化酶的溶液为DPBS；
[0022]第一核酸，用于修饰所述肌氨酸氧化酶SOX，和第二核酸，用于修饰过氧化物氧化酶HRP的第二核酸；
[0023]第三核酸，用于连接经修饰的肌氨酸氧化酶SOX和经修饰的过氧化物氧化酶HRP；
[0024]酶级联反应的底物；所述底物为肌氨酸溶液，且所述肌氨酸溶液的浓度为1
‑
100μM；
[0025]其中，所述第一核酸与所述SOX酶的摩尔比为至少5:1，且所述第二核酸与所述HRP酶的摩尔比为至少5:1；第三核酸与连接经修饰的肌氨酸氧化酶SOX和经修饰的过氧化物氧化酶HRP的摩尔比至少为1:1:1。
[0026]进一步地，(1)不同浓度肌氨酸溶液的配制：称取100mg的肌氨酸配制成1mol/L的母液，并使用DPBS(pH 8.0)缓冲溶液进行梯度稀释，每步呈10倍稀释，直至最终浓度1μM；(2)TMB缓冲溶液的配制：400μL TMB原液，150μL 10
×
PBS和450μL超纯水；(3)反应缓冲液的配制：100μL反应体系包含：40μL TMB反应缓冲液buffer，20μL混合游离酶，40μL不同浓度的肌氨酸。
[0027]更具体地，本专利技术还提供了一种测定前列腺癌特异性靶标肌氨酸的检测方法及试剂盒。
[0028]本专利技术通过肌氨酸氧化酶与辣根氧化酶的级联反应实现高特异性检测。检测原理是：肌氨酸氧化酶在肌氨酸存在的条件下催化肌氨酸产生甘氨酸、过氧化氢和甲醛，过氧化氢作为过氧化物酶反应的底物产生显色反应，从而实现肌氨酸的检测。在溶液中SOX和HRP
是处于混乱而无序的状态，随机的碰撞使酶级联反应的催化效率不足以满足检测需要的灵敏度和准确度。
[0029]而且，基于DNA双链的碱基与碱基间距离规律和计算可以得出，通过第三条单链大约42个碱基连接的双种酶间间距在12.8nm，这区别于游离酶。由于酶间距的降低，显著提高检测速率、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸介导的酶级联反应的肌氨酸的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：通过核酸调控肌氨酸氧化酶SOX和过氧化物氧化酶HRP之间的间距，以将酶级联反应限定在纳米级的特定区域；步骤2：显色反应，并测定肌氨酸含量。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1包括：向SOX酶溶液中加入交联剂，孵育，测定其SOX的浓度；加入第一核酸，孵育使所述第一核酸连接SOX酶分子，获得连接第一核酸的SOX酶分子；其中所述连接第一核酸的SOX酶中每个SOX酶分子连接至少1条第一核酸链；和向HRP酶溶液中加入交联剂，孵育，测定其HRP酶的浓度；加入第二核酸，孵育使所述第二核酸连接HRP酶分子，获得连接第二核酸的HRP酶分子；其中所述连接第二核酸的SOX酶中每个SOX酶分子连接至少1条第二核酸链。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一核酸和第二核酸是脱氧核糖核酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一核酸、第二核酸和第三核酸是寡核苷酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一核酸和第二核酸是脱氧核糖核酸，且所述第一核酸的序列与所述第二核酸的序列是相同或不同的。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一核酸与所述SOX酶的摩尔比为至少5:1，且所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：左小磊，董柏君，樊春海，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：