一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，包括：将枯草芽孢杆菌发酵液离心得到枯草芽孢杆菌发酵上清液；采用乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系；将枯草芽孢杆菌发酵上清液加入到双水相萃取体系，调节双水相萃取体系pH为2

【技术实现步骤摘要】
一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别是一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法。

技术介绍

[0002]抗菌脂肽类化合物是芽孢杆菌在生长过程中通过非核糖体途径产生的一类天然蛋白类抗菌物质，因具有无毒、无残留、无抗药性等特点，使其作为有潜力的抗生素替代品受到国内外广泛关注。目前为止，人们研究比较透彻的抗菌脂肽类化合物主要有芬荠素(Fengycin)、表面活性素(Surfaction)和伊枯草菌素(Iturin)三大类，其大多是低分子量的(300
‑
3000Da)脂肽类化合物，具有毒性小、可被降解、不污染环境和耐酸碱等独特的理化特性。
[0003]经研究表明，芬荠素是一类抗真菌抑制剂，可用于治疗皮肤真菌病，由于它具有广谱抗真菌性、低毒和低变态反应等特点,使其成为了一种极具价值的抗真菌药物。表面活性素是一种能降低表面张力的两亲性分子，具有乳化、洗涤、杀菌、润湿、分散、低刺激性和高皮肤相容性等特性，广泛应用在日用品和化妆品领域，比如洗面奶、洗发水和牙膏等。伊枯草菌素是一种具有环脂肽结构的两亲化合物,由非极性的脂肪酸链通过结合极性的氨基酸脂肪链组成，具有表面活性、溶血、抗真菌、抗肿瘤等作用以及独特的多重耐药能力。伊枯草菌素也是最早发现的具有抗菌活性的抗生素之一，其同系物杆菌霉素D(Bacillomycin D)对黄曲霉等霉菌具有显著的抑制作用，也是目前唯一从微生物中得到且对黄曲霉具有显著抑制作用的活性物质。此外，抗菌脂肽类化合物在生物医学、水产养殖、食品防腐、分子探针等领域也具有潜在的应用价值。
[0004]目前有关抗菌脂肽类化合物的提取工艺，大多采用酸化沉淀、有机溶剂萃取、吸附法和泡沫分离法等提取工艺，这些提取工艺一般都需要花费很长的时间。而且，酸化沉淀需要使用大量的酸，不仅污染环境、还需进行后续处理增大生产成本；有机溶剂萃取使用大量有毒试剂对人体和环境危害极大。因此，迫切需要一种工艺简单易行，适合工业化生产，快速分离抗菌脂肽的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种提取速度快、收率高的提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0007]一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、枯草芽孢杆菌发酵培养，将枯草芽孢杆菌发酵液离心得到枯草芽孢杆菌发酵上清液；
[0009]S2、采用乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系，其中双水相萃取体系中乙醇的体积分数为20
‑
40％，硫酸铵的质量分数为10
‑
30％；
[0010]S3、将枯草芽孢杆菌发酵上清液加入到双水相萃取体系得到混合液，调节双水相萃取体系pH为2
‑
8，所述混合液中枯草芽孢杆菌发酵上清液的体积分数为50
‑
70％，搅拌混合均匀，静置萃取分相，收集上相萃取液；
[0011]S4、向上相萃取液中加入其体积1
‑
3倍的乙醇，析出硫酸铵沉淀，将硫酸铵沉淀过滤，收集滤液；
[0012]S5、将步骤S4中的滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。
[0013]进一步地，所述步骤S1中枯草芽孢杆菌发酵培养所用的发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0。
[0014]进一步地，所述步骤S1中，枯草芽孢杆菌发酵液离心是在转数为8000r/min的离心机中进行固液分离，离心时间10min。
[0015]进一步地，所述步骤S3中，萃取温度为20
‑
40℃，搅拌时间为10
‑
20min，搅拌机转速为100
‑
200rpm，静置分相时间为10
‑
30min。
[0016]优选地，所述步骤S5中，旋转蒸发仪温度为60℃，压力为0.1Mpa。
[0017]优选地，所述步骤S2中，双水相萃取体系中乙醇的体积分数为35％，硫酸铵的质量分数为20％，双水相萃取体系的pH为6。
[0018]本专利技术的原理为：采用了双水相萃取技术，选择乙醇/硫酸铵体系作为成相组分，乙醇/硫酸铵体系能提供正负离子，影响溶液中正负离子在两相间的分配，进而改变分配系数，从而影响抗菌脂肽在两相间的选择性分配，同时使用乙醇作为成相组分，能有效降低乳化现象，成相后的滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术与现有抗菌脂肽类化合物提取技术相比，可保持生物活性物质的活性及构象，在天然产物提取方面具有广阔的应用前景。
[0021]本专利技术避免了挥发性有机溶剂的使用，提取速度快，抗菌脂肽类化合物的收率高，且萃取后的乙醇和硫酸铵可循环使用，不会造成环境污染问题。
[0022]本专利技术无需特殊设备，易于连续化操作，生产成本低，适合不同规模的工业化生产要求。
附图说明
[0023]图1为硫酸铵(质量分数为20％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。
[0024]图2为硫酸铵(质量分数为25％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。
[0025]图3为硫酸铵(质量分数为30％)时不同乙醇体积分数对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。
[0026]图4为不同pH双水相萃取体系对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物萃取率的影响(注：误差线代表标准偏差(n＝3))。
[0027]图5为双水相萃取枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0029]实施例1
[0030](1)使用发酵培养基发酵培养枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌发酵液，所用发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，磷酸氢二钾5.0g，其余为水，所述发酵培养基的pH为7.0；枯草芽孢杆菌发酵液在8000rpm离心10min，除去沉淀的菌体，收集上清液备用；
[0031](2)按比例向步骤(1)制备的发酵上清液中少量多次添加硫酸铵，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，再缓慢流加乙醇，使得双水相萃取体系总体积为100mL。其中硫酸铵的质量分数为20％，乙醇的体积分数分别为20％、25％、30％、35％、40％，建立双水相萃取体系，调节双水相萃取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、枯草芽孢杆菌发酵培养，将枯草芽孢杆菌发酵液离心得到枯草芽孢杆菌发酵上清液；S2、采用乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系，其中双水相萃取体系中乙醇的体积分数为20
‑
40％，硫酸铵的质量分数为10
‑
30％；S3、将枯草芽孢杆菌发酵上清液加入到双水相萃取体系得到混合液，调节双水相萃取体系pH为2
‑
8，所述混合液中枯草芽孢杆菌发酵上清液的体积分数为50
‑
70％，搅拌混合均匀，静置萃取分相，收集上相萃取液；S4、向上相萃取液中加入其体积1
‑
3倍的乙醇，析出硫酸铵沉淀，将硫酸铵沉淀过滤，收集滤液；S5、将步骤S4中的滤液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到枯草芽孢杆菌抗菌脂肽类化合物。2.根据权利要求1所述的提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S1中枯草芽孢杆菌发酵培养所用的发酵培养基每升含有以下组分：葡萄糖10....

【专利技术属性】
技术研发人员：丛丽娜，关长城，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：