寡肽-1盐酸盐的制备方法技术

本发明专利技术涉及多肽制备技术领域，尤其涉及寡肽-1盐酸盐的制备方法。本发明专利技术提供的方法，以PEG为载体，以二氯甲烷为反应溶剂，该方法节约了原料的用量，降低了制备成本，同时也降低了有机溶剂的用量，提高了环保优势。实验表明，以该方法制备寡肽-1盐酸盐，总收率可达83.4％，产物纯度为98.3％。产物纯度为98.3％。

【技术实现步骤摘要】
寡肽-1盐酸盐的制备方法


[0001]本专利技术涉及多肽制备
，尤其涉及寡肽-1盐酸盐的制备方法。

技术介绍

[0002]寡肽-1是一个三肽分子，序列是GHK。寡肽-1自然存在于人的血液、唾液和尿液当中。1973年Dr.Loren Pickart首先分离到了GHK-Cu，它是在研究对老化组织和年轻组织同样起作用的活性物质中发现的三肽物质，接下来的研究证明这种三肽的序列是甘氨酸-组氨酸-赖氨酸，并且与铜离子有很强的亲和力，形成GHK-Cu复合物。研究证明GHK是以与铜离子形成复合物的形式发挥功能。最初实验发现，GHK能增加大鼠正常肝细胞的存活率，能促进肝癌细胞的生长，刺激这些细胞DNA和RNA的合成。接下来的研究中发现，GHK和GHK-Cu复合物能促进多种细胞和组织的生长、分裂和分化。GHK-Cu复合物还可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成。另据报道，GHK存在于人的I型胶原a2(I)链中，说明可能参与伤口愈合和组织修复的过程。有实验表明，GHK-Cu复合物可加速大鼠、小鼠、猪和马伤口的愈合。
[0003]生物材料中提取寡肽-1往往会造成生物活性的损失，且常伴随铜离子或铁离子的螯合。这些金属离子对从血浆中分离寡肽-1的多个步骤都会产生干扰，因此目前采用化学合成法制备寡肽-1。
[0004]已报道的寡肽-1固相方法中以2-CTC树脂为载体，逐步偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后采用TFA将GHK从树脂上切除下来，得到GHK粗品。也有关于液相合成法合成三肽GHK的报道，该方法对甘氨酸的氨基、组氨酸的咪唑基、赖氨酸的侧链氨基进行保护，得到中间体Boc-Gly、His(trt)和Lys(Boc)；接肽反应以DMF为反应溶剂，N-羟基苯并三唑(HOBt)，N，N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)为复合缩合剂，三氟乙酸(TFA)切除保护基团。寡肽-1的另一种液相合成方法中，先将Trt Gly OH与N羟基琥珀酰亚胺反应生成Trt Gly OSu，再与HHis(Trt)OH反应生成Trt GlyHis(Trt)OH，然后与N羟基琥珀酰亚胺反应生成TrtGly His(Trt)OSu，最后与Lys(Trt)OH反应生成Trt Gly His(Trt)Lys(Trt)OH，将Trt Gly His(Trt)Lys(Trt)OH在醋酸中脱掉保护基团即可生成GHK醋酸盐。
[0005]可见，目前合成GHK方法主要有固相合成与液相合成两种，固相方法反应，后处理简便，溶剂用量小，绿色环保。但由于非均相反应反应效率低下，需要大量的反应原料，而且单批次产量一般均在几十公斤以下，造成制备成本很高。液相反应属于均相反应，反应易于规模化，可单批在百公斤甚至吨以上，从而实现较低的生产成本。但液相反应使用大量的有机溶剂，特别是商业化生产时，单位溶剂的损耗量十分巨大，部分还需要危险操作，不符合绿色环保的要求。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种寡肽-1盐酸盐的制备方法，该方法能够降低有机溶剂的用量，收率高。
[0007]本专利技术提供的寡肽-1盐酸盐的制备方法，包括：
[0008]步骤1：以二氯甲烷为溶剂，将Fmoc-Lys(Boc)-OH与PEG偶联，制备Fmoc-Lys(Boc)-PEG；
[0009]步骤2：依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH和Boc-Gly-OH，制得Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-PEG；
[0010]步骤3：Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-PEG经裂解，制得寡肽-1盐酸盐。
[0011]从原料及试剂使用量来说，本专利技术提供的方法替换了固相昂贵的反应树脂，采用了价格低廉的PEG，与液相反应相比，氨基酸采用固相常用氨基酸，价格也比液相的特定氨基酸价格低廉。并且，固相反应氨基酸一般使用量都要在3倍以上，而本专利技术只需要1.2倍。与液相相比，溶液使用种类相对单一，使用量一般为液相反应的1/3，具有明显环保优势。从反应步骤考虑，反应步骤相比液相合成处理方式单一简便，有发展为自动化的潜力。从规模上考虑，由于反应时是均相反应，理论上也液相一致，本专利技术提供的方案可以实现单批吨级产量，比固相反应具有明显优势。
[0012]实验表明，合成中载体分子量是影响合成效果的关键的因素，分子量过低，在各种溶剂中都可能部分或全部溶解，无法作为合成的载体。并且，随着偶联氨基酸数量的增加，氨基酸的性质也会逐步影响PEG的性质，因此，PEG的分子量不能过小。但PEG的分子量过大会降低溶解性，使其很难实现反应均质。因此，必须选择适当的分子量的PEG。
[0013]本专利技术中，所述PEG的分子量为2000～8000。一些实施例中，所述PEG的分子量为3000～6000，另一些实施例中，PEG的分子量为2000～4000。一些具体实施例中，PEG的分子量为2000或4000。
[0014]本专利技术步骤1中所述偶联的偶联剂为EDC、HCl和化合物A的组合物；所述化合物A为HOBt或HOAt；步骤1中，PEG、Fmoc-Lys(Boc)-OH、化合物A、EDC的摩尔比为1：1.2：1.2：1.2。所述偶联反应的条件为室温搅拌3h。
[0015]实验表明，反应中要选择合适的反应溶剂，该溶剂需在反应时能够溶解PEG及氨基酸偶联PEG后的物质。且反应结束后，反应液减压蒸馏，除去部分反应溶剂，需要选择合适的沉淀剂，使已偶联氨基酸的PEG载体能够完全从溶剂中析出。本专利技术中，偶联反应的溶液选自二氯甲烷，四氢呋喃，氯仿等，其中，采用二氯甲烷作为溶剂进行反应的收率最优。一些实施例中，所述沉淀剂为正己烷，乙醚或甲基叔丁基醚。
[0016]第一个氨基酸偶联完后需要用乙酰化试剂处理，确保所有PEG上可能的残余基团被封闭；本专利技术步骤1中，所述偶联后还包括乙酰化的步骤，所述乙酰化的试剂为乙酸酐和吡啶；所述乙酸酐、吡啶与PEG的摩尔比为10:10:1。
[0017]本专利技术实施例中，步骤1包括：
[0018]将PEG以二氯甲烷溶解，依次加入HOBt、Fmoc-Lys(Boc)-OH、EDC
·
HCl，搅拌反应3小时后，加入乙酸酐和吡啶继续搅拌反应3小时；然后，反应液经浓缩后以正己烷或乙醚沉淀，获得Fmoc-Lys(Boc)-PEG。
[0019]所述沉淀的条件为搅拌2h，过滤后将滤饼用正己烷冲洗3次。滤饼与35℃鼓风干燥8h。
[0020]本专利技术步骤2中偶联Fmoc-His(Trt)-OH或Boc-Gly-OH前，经脱除Fmoc保护的步骤；脱除Fmoc的制剂为DBU和二乙胺；其中DBU和二乙胺的摩尔比为0.25:3.75。脱保护反应中的
条件为0～5℃添加脱保护剂，室温搅拌反应2h。步骤2中，带有Fmoc保护剂的产物、DBU和二乙胺的摩尔比为0.25、0.25:3.75。
[0021]本专利技术步骤2中所述偶联的溶剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.寡肽-1盐酸盐的制备方法，包括：步骤1：以二氯甲烷为溶剂，将Fmoc-Lys(Boc)-OH与PEG偶联，制备Fmoc-Lys(Boc)-PEG；步骤2：依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH和Boc-Gly-OH，制得Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-PEG；步骤3：Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-PEG经裂解，制得寡肽-1盐酸盐。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PEG的分子量为2000～8000；优选的，PEG的分子量为2000～4000。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述偶联的偶联剂为EDC、HCl和化合物A的组合物；所述化合物A为HOBt或HOAt；步骤1中，PEG、Fmoc-Lys(Boc)-OH、化合物A、EDC的摩尔比为1：1.2：1.2：1.2。4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述偶联后还包括乙酰化的步骤，所述乙酰化的试剂为乙酸酐和吡啶；所述乙酸酐、吡啶与PEG的摩尔比为10:10:1。5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1包括：将PEG以二氯甲烷溶解，依次加入HOBt、Fmoc-Lys(Boc)-OH、EDC
·
HCl，搅拌反应3小时后，加入乙酸酐和吡啶继续搅拌反应3小时；然后，反应液经浓缩后以正己烷或乙醚沉淀，获得Fmoc-Lys(Boc)-PEG。6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中偶联Fmoc-His(Trt)-OH或Boc-Gly-OH前，经脱除Fmoc保护的步骤；脱除Fmoc的制剂为DBU和二乙胺；其中DBU和二乙胺的摩尔比为0.25:3.75。7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述偶联的溶剂为二氯甲烷；所述偶联的偶联剂为ED...

【专利技术属性】
技术研发人员：宓鹏程，潘俊锋，刘建，
申请(专利权)人：深圳瑞德林生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：