一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法，具体地，提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法，尤其涉及基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科毛形病毒属成员。甘薯褪绿矮化病毒是危害甘薯的主要病毒之一，主要由烟粉虱传播，特别重要的是，甘薯褪绿矮化病毒可与甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病(sweet potato virus disease，SPVD)。甘薯病毒病是甘薯上是最严重的病毒病害之一，通常可使甘薯减产50％
‑
98％，甚至绝收。
[0003]甘薯褪绿矮化病毒的检测方法主要有：目测法、指示植物检测法、酶联免疫吸附法、免疫电镜法、核酸杂交法、RT
‑
PCR法。
[0004]本专利技术提供了一种新型的检测甘薯褪绿矮化病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行甘薯褪绿矮化病毒检测的方法、系统和试剂盒。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种用于检测甘薯褪绿矮化病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯褪绿矮化病毒的核酸。
[0007]本专利技术中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。
[0008]在一个实施方式中，所述gRNA自5
’
端至3
’
端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。
[0009]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.4、5、6、7任一所示的序列。
[0010]在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。
[0011]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.4、5、6、7任一所示的序列。
[0012]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.4
‑
7任一所示的
序列相比，在SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。
[0013]所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0014]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.4
‑
7任一所示。
[0015]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0017]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.10所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病。
[0019]进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。
[0020]进一步的，所述方法还包括采用引物对进行扩增获得待测核酸的步骤。
[0021]所述引物对的上游引物如SEQ ID NO：11或13所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：12或14所示。
[0022]在一个实施方式中，所述引物对选自如下i和/或ii：
[0023]i、引物对的上游引物如SEQ ID NO：11所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：12所示；
[0024]ii、引物对的上游引物如SEQ ID NO：13所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：14所示；
[0025]优选的，引物对的上游引物如SEQ ID NO：11所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：12所示。
[0026]本专利技术中，所述待测核酸可以是双链核酸，也可以是单链核酸。
[0027]本专利技术所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。
[0028]本专利技术中，所述样品可以为来自植物的样品，例如，甘薯、马铃薯；其他的实施方式中，所述样品还可以来自其他植物，例如，烟草。
[0029]在一个实施方式中，所述样品可以为植物的传毒介质，例如，薯苗、薯块、烟粉虱、蚜虫样品。
[0030]在其他的实施方式中，所述样品还可以来源于环境样品，例如，空气、水体、土壤等。
[0031]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯褪绿矮化病毒的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器；优选的，还包括上述引物对。
[0032]另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘薯褪绿矮化病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯褪绿矮化病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列相比，在SEQ ID No.4
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
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5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.4
‑
7任一所示。2.一种检测/诊断甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、权利要求1所述的gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病。3.根据权利要求2所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，赵莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：