本发明专利技术涉及一种脂质体的制备方法，具体涉及一种负载噬菌体内溶素的阳离子瓜尔胶脂质体的制备方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：a)将磷脂、胆固醇和弹性增强剂溶解在有机溶剂中形成预混物；b)从所述预混物中蒸发掉所述有机溶剂以形成磷脂膜；c)噬菌体内溶素和阳离子瓜尔胶共混的体系与磷脂膜的水合；d)均化，以形成脂质体的包被液，包被液中噬菌体内溶素与阳离子瓜尔胶的重量比为1：1至1：15。本发明专利技术制得的脂质体对副溶血弧菌具有有效的杀菌活性，经过高温和冻干处理后仍保留很强的杀菌活性。的杀菌活性。
【技术实现步骤摘要】
一种负载噬菌体内溶素的阳离子瓜尔胶脂质体的制备方法
[0001]本专利技术涉及一种脂质体的制备方法，具体涉及一种负载噬菌体内溶素的阳离子瓜尔胶脂质体的制备方法，属于生物
技术介绍
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)属于弧菌属，是一种重要的革兰氏阴性人畜共患致病菌，广泛存在于各种海产品中。生食或食用未熟透的被副溶血弧菌污染的食物极易引发急性肠胃炎，和头痛、腹泻、恶心呕吐、低烧等症状，全世界因该病原体引起的细菌性胃肠炎的比例超过45％。近几十年来，由于在养殖生产中滥用抗生素导致副溶血性弧菌对多种抗生素表现出高度耐药性。部分亚洲和欧洲国家(韩国、中国、意大利和波兰等)从海产品中分离出的副溶血性弧菌对氨苄西林、利福平、链霉素等抗生素具有较高的耐药性。
[0003]噬菌体内溶酶是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，具有裂解速度快、特异性强、安全性高、不易产生耐药性等优势，是抗生素的理想替代品。内溶素Lysqdvp001来源于副溶血弧菌噬菌体qdvp001，比其亲本噬菌体具有更广泛的裂解谱，表现出对多种弧菌的肽聚糖裂解活性。在副溶血弧菌耐药性日益严重的现在，内溶素Lysqdvp001作为一种控制耐多药副溶血弧菌的潜在武器具有一定的优势。但副溶血弧菌具有革兰氏阴性菌特有的外膜结构，细菌外膜阻止了内溶素到达其目标肽聚糖底物，使副溶血弧菌对内溶素的直接应用不敏感，限制了内溶素在控制副溶血弧菌危害方面的应用。
技术实现思路
[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种负载噬菌体内溶素的阳离子瓜尔胶脂质体的制备方法，该脂质体对副溶血弧菌具有很好的杀菌效果。
[0005]为实现上述目的，本专利技术具体采用以下方案：
[0006]一种脂质体的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0007]a)将磷脂、胆固醇和弹性增强剂溶解在有机溶剂中形成预混物；
[0008]b)从所述预混物中蒸发掉所述有机溶剂以形成磷脂膜；
[0009]c)噬菌体内溶素和阳离子瓜尔胶共混的体系与磷脂膜的水合；
[0010]d)均化，以形成脂质体的包被液，包被液中噬菌体内溶素与阳离子瓜尔胶的重量比为1：1至1：15。其中，构成磷脂膜的磷脂、胆固醇和弹性增强剂的用量为本领域技术人员常规选择，在本专利技术中不做赘述。
[0011]阳离子瓜尔胶是由瓜尔胶经季铵化反应合成的阳离子多糖，经专利技术人研究发现，由于其本身带正电，添加至脂质体可以有效提高脂质体的表面正电荷，靶向细菌带负电的表面环境，提高脂质体的杀菌效果。
[0012]本专利技术的脂质体包含磷脂。磷脂可选自天然磷脂、合成磷脂、以及它们的组合。卵磷脂为其中一种天然来源的磷脂。卵磷脂是存在于蛋黄和大豆等物质中的混合物。它包含
多种磷脂，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、和磷脂酰肌醇(PI)。天然磷脂也包括例如氢化大豆PC(HSPC)、鞘磷脂、和磷脂酰甘油(PG)。
[0013]本专利技术的脂质体包含弹性增强剂。优选的，弹性增强剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、聚山梨醇酯80(Tween80)、脱水山梨糖醇单油酸酯(Span80)、油酸、甘草酸二钾盐(KG)和胆固醇醚中的一种或几种。优选的，弹性增强剂为表面活性剂，例如阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选非离子表面活性剂。进一步优选地，非离子表面活性剂为Tween80、Span
‑
80或聚氧乙烯胆固醇醚中的一种或几种。
[0014]作为优选，所述脂质体包被液包括，有效量的磷脂、胆固醇和弹性增强剂，以及噬菌体内溶素0.1
‑
0.8mg/mL，配方量的阳离子瓜尔胶。
[0015]作为优选，所述脂质体包被液的10mL体系含有：大豆卵磷脂80μg、胆固醇20μg、副溶血弧菌噬菌体内溶素2
‑
8mg、阳离子瓜尔胶10
‑
30mg和Tween80 8
‑
12μL。所述的大豆卵磷脂、胆固醇、Tween80均为商品化的食品级材料或添加剂，适用于工业化生产。
[0016]作为优选，该方法包括以下步骤：
[0017]S1、内溶素的预处理：利用大肠杆菌表达重组噬菌体内溶素，热处理使其部分变性后，离心除去沉淀获得内溶素溶液；
[0018]S2、磷脂膜的制备：将磷脂、胆固醇、弹性增强剂溶解于有机溶剂的混合体系中得到预混物，将预混物旋蒸，在容器的内壁上形成磷脂膜，干燥；
[0019]S3、磷脂膜的水合：向步骤S1制得的热变性内溶素溶液中加入阳离子瓜尔胶，使热变性内溶素与阳离子瓜尔胶的重量比为1：1至1：15，得到的混合液加入步骤S2所述的容器中，旋蒸，以使磷脂膜与容器壁分离，水化充分溶于混合液中；
[0020]S4、脂质体包被液的制备：混合液经水浴超声处理后，得到脂质体包被液。
[0021]内溶素热处理的目的是：加热使内溶素部分变性，可以让内溶素的蛋白结构展开，内部疏水基团暴露，提高内溶素的疏水性和与细菌膜的相互作用能力，经实验证实，相比于未经加热的天然内溶素，热变性得到的内溶素杀菌活性有显著提升。
[0022]S1中，内溶素的热处理对内溶素的酶活性没有显著影响，可提高内溶素杀菌活性，热处理条件温和，避免了蛋白在极端条件下的聚集和变性失活。内溶素热处理的温度为70
±
2℃，加热时间1
‑
6min；最佳温度为70℃加热6min。
[0023]作为优选，S2和S3中，旋蒸的条件是：在40
±
2℃条件下以70
±
10RPM的转速下旋蒸。
[0024]作为优选，S1中，利用镍柱纯化和透析进行脱盐处理获得纯度较高的内溶素，调节得到的内溶素溶液，使内溶素溶液中内溶素浓度为200
‑
400μg/mL。
[0025]作为优选，S2中，干燥的条件是60℃干燥2h。
[0026]作为优选，所述有机溶剂是由10mL氯仿与甲醇2：1的体积比组成。
[0027]作为优选，S4中，所述水浴超声处理的条件是：在室温下，频率为40Hz条件下，水浴超声时间为2h。
[0028]作为优选，步骤S1中，重组噬菌体内溶素的制备方法包括：
[0029]将可表达内溶素的工程菌Rosetta(Lysqdvp001)接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡(150r/min)过夜培养；
[0030]次日，按照1：50的比例将过夜培养的菌液加入到新鲜的LB液体培养基中(300mL,
含有50μg/mL卡那霉素)，37℃150r/min培养2
‑
3h至OD
600nm
大约0.6；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃150r/min诱导4h；
[0031]然后在4000r/min，4℃条件离心20min，去上清，用缓冲液(含20mmol/LNa2HP本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种脂质体的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤：a) 将磷脂、胆固醇和弹性增强剂溶解在有机溶剂中形成预混物；b) 从所述预混物中蒸发掉所述有机溶剂以形成磷脂膜；c) 噬菌体内溶素和阳离子瓜尔胶共混的体系与磷脂膜的水合；d) 均化，以形成脂质体的包被液，包被液中噬菌体内溶素与阳离子瓜尔胶的重量比为1：1至1：15。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述脂质体包被液包括，有效量的磷脂、胆固醇和弹性增强剂，以及噬菌体内溶素0.1
‑
0.8 mg/mL，配方量的阳离子瓜尔胶。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：弹性增强剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、聚山梨醇酯80（Tween80）、脱水山梨糖醇单油酸酯（Span80）、油酸、甘草酸二钾盐（KG）和胆固醇醚中的一种或几种。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述脂质体包被液的10 mL体系含有：大豆卵磷脂 80
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g、胆固醇 20
ꢀµ
g、副溶血弧菌噬菌体内溶素2
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8 mg、阳离子瓜尔胶10
‑
30 mg和Tween80 8
‑
12
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L。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤：S1、内溶素的预处理：利用大肠杆菌表达重组噬菌体内溶素，热处理使其部分变性后，离心除去沉淀获得内溶素溶液；S2、磷脂膜的制备：将磷脂、胆固醇、弹性增强剂溶解于有机溶剂的混合体系中得到预混物，将预混物旋蒸，在容器的内壁上形成磷脂膜，干燥；S3、磷脂膜的水合：向步骤S1制得的内溶素溶液中加入阳离子瓜尔胶，使内溶素与阳离子瓜尔胶的重量比为1：1至1：15，得到的混合液加入步骤S2所述的容器中，旋蒸，以使磷脂膜与容器壁分离，水化充分溶于混合液中；S4、脂质体包被液的制备：混合液经水浴超声处理后，得到脂质体包被液。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述方法还包括：...
【专利技术属性】
技术研发人员：王静雪，林洪，宁厚齐，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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